区分血中白血球的试剂和方法技术

本发明专利技术涉及一种溶解剂和使用该溶解剂自动区分血液中白血球亚群的方法。尤其是，新的溶解剂溶解红血球并作用于能够区分至少一种白血球亚群的嗜酸性细胞。该溶解剂为酸，含有烷基硫酸的碱金属盐的高渗水溶液，嗜酸性细胞溶解剂，非离子表面活性剂和生理盐分。当与第二种溶解剂一起使用时，能够用ＤＣ和ＲＦ测量区分白血球的至少五个部分。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种溶解剂和一种通过适宜的电子仪器手段区分血样中白血球亚群的方法。由血样分析白血球群体是诊断众多疾病方法中必要的和基本的部分。测量白血球亚群的嗜酸性细胞对于诊断某些疾病来说是重要的。例如，发现在何杰金病、寄生虫和过敏性疾病中，嗜酸性细胞的数量增加。传统血样分析包括将血样涂在显微镜的载玻片上，然后观察分析该载玻片。这种方法极为耗时，而且对载玻片分析的解释存在有个体差异。因此发展了利用流动性白细胞计数来自动分析白血球的方法。利用自动血液仪器分析白血球方法中的一个必要步骤是溶解红细胞。到目前为止，已经开发了用于全血样品的一些溶解试剂。美国专利4485175(Ledis等)描述了一种试剂系统和用自动细胞计数装置将白血球区分为三种亚群的方法。该试剂系统含有血稀释剂和溶解试剂。该溶解试剂含有季铵表面活性剂的混合物。然而，该试剂系统将其用途限定到将白血球区分为三种亚群淋巴细胞、单核细胞和粒细胞。该试剂系统不能进一步将粒细胞区分为另外的三种亚群。美国专利4751179(Ledis等)公开了一种试剂系统和用自动细胞计数装置区分白血球的方法。该试剂系统含有1)溶解试剂，其含有含皂草甙的单一溶解稀释剂或者含有由预稀释剂和含皂草甙的溶解试剂组成的顺序加入两种溶液；和2)一种活性交联剂，如作为固定剂的戊二醛。加热血样溶解试剂系统混合物并通过DC和混浊度对其分析之后，可确定四种白血球亚群。这四种亚群为淋巴细胞、单核细胞，噬中性细胞和嗜酸性细胞。该方法要求，在通过仪器测定之前，需将样品混合物在60-75℃下加热。美国专利5155044(Ledis等)公开了一种试剂系统和用于全血样品的快速分离和白血球分析并能使用可测量传导率(DC)、放射频率(RF)和光散射(LS)的自动血液分析仪来自动区分为五种亚群。该试剂系统由含有酸或酸和皂草甙混合物的水性溶解试剂和水性盐淬灭(quench)溶液组成。该方法是快速的并且在一步测量中能够从全血样品中区分5部分白血球。该单一测量步骤是用相同的溶解试剂系统测量单个血液等分试样来区分白血球。然而，使用该试剂和方法来将白血球区分为五种亚群需要高级和昂贵的激光装置。如果仅仅用这种试剂系统的DC和RF检测，粒细胞亚群不会被完全区分为嗜碱性细胞、嗜酸性细胞和嗜中性细胞亚群。不能区分粒细胞，这是因为在该专利所述条件下，亚群的DC和RF信号相互重叠。通过DC和RF测量将白血球区分为四或五种亚群的另一方法是使用多种试剂和进行多步测量。各个试剂用于区分特定的亚群。通常，使用第一种溶解试剂(如美国专利5116539(Hamaguchi等)和美国专利5389549(Hamaguchi等)所述)来通过测量DC和RF将白血球区分为三种亚群(即，单核细胞、淋巴细胞和粒细胞)。在美国专利5116539中，使用另一种溶解试剂进行另一个测量而获得嗜酸性细胞亚群。这能够区分为淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性细胞和剩余的粒细胞四部分。该溶解试剂是一种由聚氧乙烯非离子表面活性剂和将溶液PH调节在3-11范围内的缓冲剂组成的低渗水溶液。该溶解试剂除了嗜酸性细胞之外不仅溶解红血球也溶解白血球，这样可根据其剩余细胞的体积对嗜酸性细胞计数。然而，为了分离嗜酸性细胞，使用该溶解试剂的方法需要在40℃温度下将样品混合物培养50秒钟。这种升高温度需要明显更复杂的仪器，因为必须控制反应的热量。另外，延长反应时间会直接减少自动分析仪的工作效率。在美国专利5389549中，需要两种另外的溶解试剂并需要进行另外两次测量，获得嗜酸性细胞和嗜碱性细胞以便区分出五个部分。在该文献中，从总粒细胞群中减去分别测定的嗜酸性细胞和嗜碱性细胞的和而获得嗜中性细胞亚群。美国专利5196346(Lefevre等)公开了一种溶解试剂和使用该溶解试剂通过溶解除嗜碱性细胞之外的所有血细胞(包括红血球和白血球)来自动测定全血样品中的嗜碱性细胞的方法。溶解试剂由聚氧乙烯醚类表面活性剂、苯二甲酸/HCL混合物、十二烷基硫酸钠(SDS)和丁基化的羟基甲苯型抗氧剂。SDS用作蛋白质变性剂来减少测量仪器中沉淀的形成并且还发现可促进细胞溶解。所公开的方法要求将反应温度控制在30-40℃并局限于仅记录嗜碱性细胞的数目。未决的美国专利申请08/488630(于1995年6月8日申请)公开了一种溶解试剂系统和使用DC、RF和光散射测量装置将白血球自动区分为五种亚群的方法。该溶解试剂系统由含有乙氧基化的长链胺化合物和酸的水溶性溶解试剂和含有高渗的碱性试剂组合物的稳定剂组成。该公开的溶解试剂系统使用DC、RF和光散射测量经一次测量区分白血球的五个部分。然而，如果在仅装有DC和RF测量装置的血液分析仪上使用该溶解试剂时，仅获得四种亚群，即单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞和嗜中性细胞与嗜酸性细胞总数。另外，未决的美国专利申请08/496469(1995年6月29日申请)公开了溶解试剂和使用DC、RF和光散射测量仪将白血球自动区分为五种亚群的方法。该溶解试剂由含有聚氧乙烯表面活性剂和酸的水性溶解试剂和高渗的碱性稳定试剂组合物组成。公开的溶解试剂系统使用DC、RF和光散射测量时也一步区分白血球为五个部分。然而，如果在仅装有DC和RF测量装置的血液分析仪上使用该溶解试剂时，仅获得四种亚群，即单核细胞、淋巴细胞、嗜碱性细胞和嗜中性细胞与嗜酸性细胞总数。本专利技术涉及新的溶解试剂组合物。所述溶解试剂组合物为酸性高渗水溶液，其含有烷基硫酸的碱金属盐、嗜酸性细胞溶解剂(eosinolyticagent)、非离子表面活性剂和生理性盐。此新的溶解试剂组合物可溶解红血球并通过选择皱缩嗜酸性细胞而从其它粒细胞亚群中选择性地影响和分离嗜酸性细胞亚群。这样至少能够区分一种白血球亚群。该溶解试剂组合物具有完全在室温下操作的优点。为了完全分离嗜酸性细胞亚群，现有技术在升高的温度(30℃或更高)下进行。这种升高温度需要明显更复杂的仪器，因为必须控制反应的热量。本专利技术通过在室温下最佳操作克服了需要控制温度的缺陷。另外，本专利技术涉及使用溶解试剂组合物自动测定血中白血球亚群的方法。本专利技术的方法包括将血样与溶解试剂组合物混合、在室温下将样品混合物培养不超过25秒钟并用自动血液仪分析样品混合物。表面活性剂的协同效果对嗜酸性亚群产生快速选择性的作用，通过简单的DC和RF测量快速从其它白血球亚群中分出嗜酸性细胞亚群。而且，该方法具有不需要昂贵的激光装置测定嗜酸性细胞亚群的优点。另外，本专利技术涉及使用新的溶解试剂组合物和第二种溶解试剂来仅通过DC和RF测量而获得至少白血球的五个部分区分。附图说明图1a和1b显示按实施例I所述方法由正常全血样品中区分的嗜酸性细胞。图1a显示DC与OP(混浊度，RF和DC的函数)的二维图且图1b分别显示RF与OP的图。白血球亚群作为标记物来显示。图2显示按实施例I所述方法进行的全血样品DC与旋转光散射(RLS)图，与实施例I不同的是用装有DC、RF和光散射装置的实验性血液分析仪通过集中流动法(focused flow method)进行分析。图3a和3b显示按实施例II的方法使用本专利技术列举的溶解试剂组合物所进行的全血样品二维图。图4显示使用实施例IV所述第二种溶解试剂的例子和实施例VI所述的稳定剂并按实施例VII的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种水性溶解剂组合物，含有：ａ）烷基硫酸的碱金属盐，ｂ）酸，ｃ）促进嗜酸性细胞亚群选择皱缩的选自有机磷酸酯、有机磷酸酯的碱金属盐、乙氧基化磷酸酯、乙氧基化硫醇、乙氧基化羊毛醇、乙氧基化烷基苯酚、乙氧基化烷醇、乙氧基化烯醇及其混合 物的嗜酸性细胞溶解剂，ｄ）保护嗜中性细胞不受溶解的非离子表面活性剂，和ｅ）足以将所述溶解试剂组合物的重量克分子渗透压浓度调节在３７０－７２０ｍＯｓｍ之间的生理盐分。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：李毅，C尤恩格，SC维兰斯，
申请(专利权)人：库特国际公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]