全血循环癌和/或血液祖细胞的检测，识别，计数和确认方法技术

一种分析血液以在一定放大倍数下分离、检测、计数和确认已知在血液里循环的癌细胞和／或血液祖靶细胞是否存在的方法。该分析是在取样管中离心抗凝处理的全血样本里进行的，包括形态和表位检测。把荧光剂与抗靶表位的抗体偶联。用显示胞内细胞结构的胞内染色剂例如吖啶橙将血样中的细胞染色，可以进行形态分析。两类分析都优选在离心血样内血小板层上或附近进行。在一定放大率下目测和／或光度测定来进行形态和／或表位分析。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到一种对装在一种透明取样管装置内的抗凝处理过的全血样本中循环癌和/或血液祖细胞的检测、鉴别、计数和确认的方法和装置。在该取样管装置内能够操作检测、鉴别、计数和确认的全部步骤。更具体地说，本专利技术的方法包括采用这样一种方式对血样成分按离心密度分离，该方式能够确保由于循环癌和/或血液祖细胞的密度将血样内的循环癌和/或血液祖细胞以物理方式置于血样和取样管装置中预定的轴向位置，也进入到取样管装置中与取样管壁邻接的限制性光学面，最后进入到该光学面的一个明确的区域。细胞学是涉及哺乳动物细胞形态特征的科学和技术。在人类医学和兽医学上细胞学都具有临床实用性。细胞学最常用于诊断在脱落细胞或收获细胞中是否存在恶性肿瘤，那些脱落细胞或收获细胞一般a)脱落在体腔里，例如胸膜间隙或腹膜；b)脱落在排出的体液里，例如分泌的唾液或排泄的尿液；c)通过刮或刷体表，例如子宫颈、子宫腔或支气管粘膜得到；或者d)通过直接从肿瘤，例如甲状腺、乳腺、肺或者类似器官的肿瘤中用针抽吸得到。然后一般将该脱落或收获的细胞固定、染色和目测研究，通常采用亮视野电子显微术，然后，如果需要的话，就采用免疫染色和/或其它的分子技术研究。本年度美国有近560,000人会死于实体肿瘤(主要是癌)。本来通过对恶性肿瘤的早期诊断可以防止其中的许多人死亡。遗憾的是，除检测前列腺癌的前列腺特异抗原(PSA)试验可能是例外之外，还没有发现通过血液分析对实体肿瘤的早期检测有效的切实可行的常规方法。在美国，通过宫颈癌的早期检测，巴氏涂片已经把宫颈癌死亡率降低了70％以上。对其它实体肿瘤的类似试验的开发可能对总体癌症死亡率有相似的影响。现已经证实了循环癌细胞的存在，该癌细胞由癌性肿瘤自然脱落到供给肿瘤氧气和营养物的循环血流中。由于癌性肿瘤以所谓的血液循环路线扩散并且在非常稀有的病例中在血液标本中已被观测到，所以几十年前有人就推断血流中存在这种细胞。最近采用逆转录酶结合聚合酶链反应(PCR)的复杂技术，借助于肿瘤的分子标记在许多癌症病人(在原位癌时和其扩散之后)中已经能够检测到肿瘤细胞的存在。另一种检测循环癌细胞的方法是采用一种公知的技术如荧光激活细胞分选法(FACS)，例如Becton Dickinson和Franklin Lakes,NewJersey公司制造的分选仪。对循环癌细胞的FACS检测包括通过检测有荧光标记的抗体和/或通过检测表位的组合或者结合这两种方法来测定癌细胞，其中抗体对抗并结合存在于癌细胞表面或内部而在正常血细胞表面或内部不存在的一种或多种表位，其中组合表位是存在于循环的正常血细胞表面或者内部的表位和可能存在于或不存在于癌细胞表面或者内部的表位。因而FACS技术是以细胞检测为基础，也就是说，它是光度测定并利用了抗体-表位的特异性，但在FACS仪器中不能就地从形态上分析细胞。为了选择特异的分子种类或免疫-表型信号，逆转录酶/PCR(分子技术)、FACS(免疫-表型法)，两者都需要所寻找的肿瘤起源是已知的。上述技术对证实癌细胞在血流中循环的理论有一定贡献，但是由于它们的费用和/或性质，就临床应用而言这些技术对于检测血流中循环的肿瘤癌细胞是否存在并非特别实用。因而，不考虑癌患者细胞的根源，用于循环癌细胞恶性本质的检测和确认的常规和普通的血液分析方法是不存在的。此外，上述的分子或免疫-表型方法均不能原地使用，即在一封闭的采样系统中，使用细胞病理学的分析以确认循环细胞的形态学特征，而这些特征就可鉴别和证实癌细胞。由于在起源上所有肿瘤细胞中大约82％是上皮细胞(其中72％的是致命的)，在循环血液中上皮癌细胞应该是能够检测的。虽然循环血流中上皮细胞的存在不能单独确认为恶性肿瘤，但是由于在循环血流中很少见到上皮细胞，它警告细胞学家有极大的可能性是恶性肿瘤。然而，在某些情况下，例如外科手术后；或者由于身体创伤；或者由于牙线，或者在前列腺炎的情况下，例如，在循环血流中也会发现非恶性上皮细胞，这是有可能的。目前细胞的目测形态分析是在循环血样中区分良性上皮细胞和癌上皮细胞的最可靠的方法。试图通过形态分析检测血液中循环癌细胞的问题之一是，只采用细胞学分析方法一般是不可能将循环的血液祖细胞、或胚细胞与循环的癌细胞区分的。少量可能存在于循环血液中的癌细胞需要细胞病理学家去仔细地检查大约一千万有核血细胞以便发现一个癌细胞，并且那一个癌细胞可能会随机地存在于一千万有核血细胞里，这些有核细胞自身又均匀分散至五十亿无核细胞的血液组分的海洋里，即，红血球，加上二亿五千万血小板，上述这一切在一亳升的血液中均会发现。这样一项作业会是非常耗时的，因而不实用于分析癌细胞是否存在的病人血液。血样中可能发现的另一类型极少的循环有核细胞是血液祖细胞(HPC)，它包括胚细胞、干细胞和其它正常循环细胞的祖细胞，其通常在循环血液样中的水平使用目前可得到的血细胞仪器如阻抗计数器和检测染色的外周血是不能检测到的。在接受化疗和接受人粒细胞集落刺激因子(HGCSF)、和其它细胞因子治疗的病人里，HPC更有可能存在，但是通常数量很少，即，每毫升样本大约1-1000个，或者更少。因而，血样中低浓度的HPC致使用常规的方法检测不到。检测和对HPC的计数是很重要的，这是因为HPC的计数能够使得HPC的收获更有效，并用于临床上重要的干细胞移植治疗。类似地，在收获HPC细胞的病人里循环的癌细胞的检测也很重要，从而使得向病人再输注所收获循环癌细胞的可能减少到最小。已经研制出一种技术，该技术是通过离心有插入物一般是漂浮物的毛细管或其它管中的混合物样品来测量复杂混合物中的组份层。该漂浮物优选是柱状的，并且具有一个特殊的比重，该比重能够使它置入离心混合物内到一定程度，在管中产生一个环形自由体积，待测层将落在其中。这样该待测层被物理延长，并且因而能被更容易地和更精确地测量。1977年6月7日授权的美国专利4,027,660、1978年4月4日授权的美国专利4,082,085、1979年5月29日授权的美国专利4,156,570，和其它的专利描述了上述技术。目前Becton Dickinson and Company以注册商标“QBC”销售这项技术。“QBC”技术适用于血样的微丝蚴感染的分离和鉴别，如在1980年2月26日授权的美国专利4,190,328中阐述的。1995年4月4日授权的美国专利5,403,714、1996年3月5日授权的美国专利5,496,704、1996年4月9日授权的美国专利5,506,145，和其它的专利描述了上述“QBC”技术检测抗凝处理的全血中各种分析物的用途；并且该技术也涉及到为确认癌肿瘤细胞是否存在而化验组织样本，其中在分析之前将组织样本与一种盐水缓冲液混合。显然目前迫切需求一种简单的方法和实施该方法的系统，其中通过快速、准确地分析毛细血管血液或静脉血样本来判断循环癌细胞和/或血液祖细胞是否存在。此外，该方法应当能够使人在血液取样装置里就地区分血液祖细胞和癌细胞；并且也能使人原地确认所检测细胞的性质。本专利技术涉及到一种以目测或光度计检测装在一个透明取样试管中抗凝处理过的全血样内的循环癌和/或血液祖细胞的方法和仪器。通过利用这样一种事实能够在几分钟内实现循环癌细胞和/或血液祖细胞的检测和确认本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测在抗凝处理的全血样品里异常循环有核靶细胞是否存在的方法，所述的方法包括以下步骤： ａ）提供一种管中含有一般为圆柱形的插入物的透明管，所述管和插入物的组合在管内形成一个明确区域； ｂ）把血样与一种或多种表位特异性标记物结合以区分血样里任何异常有核靶细胞； ｃ）把血样与能显示血样内一切有核细胞的细胞形态的着色剂结合； ｄ）把血样放置到管中并且将管中的血样离心以使血样里任何异常的有核细胞按照密度沉降到管中所述的明确区域； ｅ）对管内明确区域里原地发现的任何区分出的细胞计数； ｆ）在管内明确区域里原地检测任何区分出的细胞的细胞形态； ｇ）所述的结合步骤在放置血样到管里之前或者之后进行；并且 ｈ）在没有规定的次序下进行所述的计数和检测步骤。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：DL里马，SC沃德罗，RA莱文，P菲德尔，
申请(专利权)人：SC沃德罗，RA莱文，
类型：发明
国别省市：US[美国]