酶法测定血清镁离子试剂制造技术

本发明专利技术涉及酶学检测技术，特别是将丙酮酸激酶（ＥＣ２．７．１．４０，ＰＫ）偶联乳酸脱氢酶（ＥＣ１．１．１．２７，ＬＤＨ）用于测定血清镁离子的酶法试剂。研究表明，该试剂准确度高，精密度好，批内平均不精密度〈２．４５％，日间平均不精密度〈３．１０％，测定范围宽（０．１－２．０ｍｍｏｌ／ｌ），抗干扰能力强，与原子吸收法及比色法有极好的相关性，试剂复溶后（４℃）稳定至少５天，价廉（０．５元／ｍｌ），适用于多种自动生化分析仪和半自动生化仪以及手工测定。且由于价廉，全部试剂国产化而优于目前使用的国外各种酶法试剂。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及酶学检测技术，特别是提供一种将丙酮酸激酶(EC2.7.1.40,PK)偶联乳酸脱氢酶(EC1.1.1.27,LDH)用于测定血清镁离子的酶法试剂。镁离子是细胞内的主要阳离子，含量仅次于钾离子，其在细胞外液中的浓度为0.7-1.10mmol/L。镁离子参与机体许多生理功能，能与细胞内许多重要成分，如ATP等形成复合物，激活多种酶体系，从而对葡萄糖酵解、脂肪、蛋白质、核酸、辅酶等形成，肌肉收缩，抗体代谢过程中的转甲基作用等起调节作用；其又是氧化磷酸化的重要辅助因子，对线粒体功能有重要影响，特别与能量代谢有关；在蛋白质合成过程中，镁离子也参与mRNA和蛋白质转录等机制；另外，镁离子对维持神经肌肉的兴奋性也起重要作用。镁离子缺乏或过多，神经肌肉系统常是早期症状之一。因此血清镁离子浓度改变的临床意义越来越为医学家们所重视。血清镁离子的检测方法很多。如火焰光度法、荧光法、原子吸收分光光度法(AAS)、层析法、离子色谱法、染料比色法、和酶法等。其中以AAS法最准确、敏感、特异性也最好，但由于仪器价格非常昂贵，不易自动化操作及必须使用可燃性气体所带来的潜在危险，而很难在临床实验室推广普及。火焰光度法、荧光法、层析法、离子色谱法测定镁离子虽有报道，但临床实际应用并不多见。染料比色法是根据在碱性环境下，染料与镁离子鳌合而改变颜色这一基础建立的，包括二甲苯胺蓝法(XLB)、达蛋黄法、Calmagite法、和甲基麝香草酚蓝法(MTB)。达蛋黄法的空白值较高、干扰较大、特异性较差、测定误差率超过30％，其余的几种比色法因使用简便、经济、延用至今，尤其是Calmagite法和甲基麝香草酚蓝法(MTB)现被卫生部推荐为血清镁离子测定的常规方法。但此类方法会不同程度受到阳离子或胆红素的干扰，也会使pH发生变化而不稳定，工作试剂须新鲜配制或反复校正，为增加试剂稳定性，需加入剧毒剂氰化物，因而对操作人员有潜在的危险。1959年，Baum和Czok就提出了用异柠檬酸脱氢酶(EC1.1.1.42,ICD)来测定血清镁离子的方法，但由于种种原因，此方法一直未被临床所接受。直到近十余年，酶法在测定血清镁离子方面才得到进一步的发展。据统计，约有三百多种酶可被镁离子激活，依据这一原理，各国学者相继报道了采用酶偶联技术，测定血清镁离子的不同酶学方法。如Tabata等于1985年，报告己糖激酶(EC2.7.1.1,HK)偶联葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(EC1.1.1.49,G6PDH)的方法；1986年，他们又报道了用葡萄糖激酶(EC2.7.1.2,Gluk)取代HK，并偶联G6PDH的方法；同年，Wimmer等报告了甘油激酶(EC2.7.1.30,GK)偶联甘油-3-磷酸氧化酶(EC1.1.3.2l,GPO)和过氧化物酶(EC1.11.1.7,POD)的方法；1989年，Fossati等又报道了根据Tabata方法改进的Gluk偶联G6PDH的方法；1991年，Suzuki等报告了用磷酸葡萄糖变位酶(EC5.4.2.2,PGM)偶联G6PDH的方法。上述四种方法除甘油激酶法外，都是催化葡萄糖1-磷酸葡萄糖生成6-磷酸葡萄糖，再偶联G6PDH催化6-磷酸葡萄糖和NADP生成6-磷酸葡萄糖酸内酯和NADPH，通过340nm波长时NADPH引起的吸光度的增加，来间接计算血清镁离子的浓度。从费用上，偶联G6PDH的方法，配制一升试剂的费用，大约为4000至7000元人民币；按甘油激酶发，配制一升试剂的费用就更高，仅进口工具酶的费用在一万八千元人民币以上，而且，此方法还未解决钙离子的干扰问题。这些均成为阻碍酶法进一步推广的原因。1995年，日本的Fujita等人报告了用异柠檬脱氢酶测定镁离子的方法，并使用生化技术对ICD进行修饰，以提高此酶在水溶液中的稳定性，1996年，英国人Stone等人根据日本人发表的文章也成功的建立了此种方法，并使修饰后的酶稳定性从未修饰前的两周延长到四周以上。单配制一升试剂所需ICD和NADP的费用至少也要一万七千元以上。本专利技术的目的在于提供将丙酮酸激酶偶联乳酸脱氢酶用于测定血清镁离子的酶法试剂，且准确度高，精密度好，测定范围宽，抗干扰能力强，相关性、稳定性好。本专利技术属于对无机离子的酶法测定研究，基于研究中镁离子对兔肌丙酮酸激酶有着明显的激活作用这一发现，丙酮酸激酶(Pyruvate Kinase,PK,EC2.7.1.40)又叫三磷酸腺苷丙酮酸磷酸转移酶，是调节糖酵解的三个限速酶之一。PK在有锰离子和镁离子存在情况下催化磷酸烯醇式丙酮酸生成丙酮酸，钾和氨离子在有镁离子存在情况下，可使PK活性大大增强，这一原理被本研究用来测定镁离子浓度。由于反应产物丙酮酸并不能直接指示PK催化反应的程度，需偶联LDH系统来间接指示PK活性或产物生成量。乳酸脱氢酶(Lactate Dehydrogenase,LDH,EC1.1.1.27)是动物体内含量最多的酶之一，广泛存在于动物组织脏器内。作为工具酶，主要催化丙酮酸与乳酸之间的氧化与还原反应，同时伴有NADH和NAD之间的转换，NADH的最大吸收峰在340nm，故其浓度变化可使340nm波长下的吸光度发生变化，把LDH偶联到PK系统进行血清镁离子的测定。PK与LDH偶联反应原理如下PKPEP+ADP--→PYRUVATE+ATPMg++LDHPYRUVATE+NADH+H+--→LACTATE+NAD+反应原理磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和二磷酸腺苷(ADP)在丙酮酸激酶(PK)催化下生成丙酮酸(Pyruvate)和三磷酸腺苷(ATP)，丙酮酸又与乳酸脱氢酶系统偶联，经乳酸脱氢酶(LDH)催化生成乳酸(Lactate)，同时NADH氧化成NAD，镁离子的存在可使丙酮酸激酶活性显著增强，故NADH在340nm波长吸光度的变化可以间接反映血清镁离子的浓度。基于上述反应原理，本专利技术的试剂配方由下述浓度的R1、R2组成，其中，R1三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4 110.00mmol/L，氯化钾(KCL)25.00-50.00mmol/L，乳酸脱氢酶(LDH)1500-4000U/L，丙酮酸激酶(PK)500--1300U/L，二磷酸腺苷(ADP)1.50-6.00mmol/L，还原性辅酶I(NADH)0.25-0.50mmol/L；R2磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)2.00-6.00mmol/L，乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA)2.00-50.00mmol/L，三羟甲基氨基甲烷-氯化氢缓冲液(Tris-HCL)pH7.4 91.80mmol/L。上述试剂来源三羟甲基氨基甲烷(Tris,AR,上海试剂三厂)；丙酮酸激酶(PK,Sigma，比活性40U/mg冻干粉，上海试剂三厂)；乳酸脱氢酶(LDH，比活性30U/mg冻干粉，上海试剂三厂)；磷酸烯醇式丙酮酸(PEP,AR，上海试剂三厂)；还原性辅酶I(NADH,上海试剂三厂)；二磷酸腺苷(ADP，上海东风生化厂)；氯化钾(KCL,AR，上海东风生化厂)；乙二醇(b-氨基比林)四乙酸(EGTA，华北特种化学试剂开发中心)。本专利技术采用常规方法配制，其中Tris-HCL缓冲液的配制准确称取Tris1.21g本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种将丙酮酸激酶偶联乳酸脱氢酶用于测定血清镁离子的酶法试剂，其特征在于由下述浓度组份的Ｒ１、Ｒ２所组成，其中，Ｒ１：三羟甲基氨基甲烷－氯化氢缓冲液（Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ）ｐＨ７．４１１０．００ｍｍｏｌ／Ｌ，氯化钾（ＫＣＬ）２５．００－－５０．００ｍｍｏｌ／Ｌ，乳酸脱氢酶（ＬＤＨ）１５００－－４０００Ｕ／Ｌ，丙酮酸激酶（ＰＫ）５００－－１３００Ｕ／Ｌ，二磷酸腺苷（ＡＤＰ）１．５０－－６．００ｍｍｏｌ／Ｌ，还原性辅酶Ⅰ（ＮＡＤＨ）０．２５－－０．５０ｍｍｏｌ／Ｌ；Ｒ２：磷酸烯醇式丙酮酸（ＰＥＰ）２．００－－６．００ｍｍｏｌ／Ｌ，乙二醇（ｂ－氨基比林）四乙酸（ＥＧＴＡ）２．００－－５０．００ｍｍｏｌ／Ｌ，三羟甲基氨基甲烷－氯化氢缓冲液（Ｔｒｉｓ－ＨＣＬ）ｐＨ７．４ ９１．８０ｍｍｏｌ／Ｌ。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张孝山，帅真，李明润，李明，杨彬，温庭民，王瑛，徐海津，
申请(专利权)人：天津市医药科学研究所，
类型：发明
国别省市：12[中国|天津]