用于测定蛋白质的干式分析单元制造技术

公开了一种能被用来灵敏快速地检测和定量蛋白质的干式分析单元。该测定通过使用一种能与蛋白质和钼酸根离子反应引起所述染料的光吸收可检测的变化的染料来进行。另外还公开了稳定和提高测定精确度的聚合物以及减小碳酸氢盐干扰的化合物。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
本申请要求1997年5月6日提交的申请号为60/045754临时申请的优先权。本专利技术涉及干式分析单元及使用它来定量液体样品中蛋白质的方法。更具体地说，本专利技术涉及特定的染料和钼酸根离子，包含丙烯酰胺的聚合物以及羟基羧酸在该分析单元中的用途。在医学实践和研究以及分析和诊断方法中一直都需要快速准确地测定存在于各种液体，如生物体液中的化学和生物物质。例如，为了有效地研究、诊断和治疗许多人类疾病，必须快速准确地确定蛋白质的存在和含量。在最近几十年已经建立了各种各样的分析方法来检测这些重要物质。这些方法可信度高，并且在一些情况下适宜于自动化以及适合以试剂盒的形式使用。蛋白质分析传统上在溶液中，或者在其中液体被以某种方式从参与分析的试剂中除去的实验设备中进行。尽管在本领域中溶液方法已令人欣喜地被广泛接受，但是它们一般需要通常具有复杂的溶液处理和运输能力的分析设备。而且，用于该分析法的分析设备可能涉及复杂的液体处理，并且对于可能被需要避免样品与样品间污染的操作和严格清洗可能均需要熟练人员。作为溶液化学的一种替代方法是使用干式分析单元。但应该认识到由于来自涂层剂，如粘合剂、表面活性剂以及为促进或者利于物质沉积，样品润湿以及保持所述单元结构完整所需的其他试剂的干扰，并非所有溶液基分析测定都可适用于干式分析单元。而且，干式分析单元必须采用原位区域化以分隔不相容的成分。而在其中可采用分离的液体贮存和连续的液体加入的溶液化学中并非如此。干式分析单元以及它们的使用已在大量的出版物中被描述，包括Pierce等人的美国专利US4132528、US4786605、US3992158、US4258001，Frickey等人的美国专利US4670381，WO822601(1982年8月5日公开)，欧洲专利申请号051183(1982年5月12日公开)以及欧洲专利申请号066648(1982年12月15日公开)。其所引用的全部内容在此引入作为参考。确定和监测患者肾功能的一个有用的诊断指标是尿中的总蛋白浓度。存在于尿中的蛋白的性质和含量是变化的，且取决于导致肾脏不能阻止蛋白质进入尿中的特定的病理状态。在尿中可能发现的蛋白的实例包括，但并不仅限于，白蛋白、完整的免疫球蛋白、κ自由链、λ自由链、维生素A结合蛋白、α-1-微球蛋白和β-1-微球蛋白。这些蛋白质在氨基酸组成和分子量上大不相同。使用尿总蛋白筛选检测分析的临床医生所感兴趣的信息是每单位体积尿样中的蛋白质的总量。诊断分析，即所测信号在理想状态下应与可能存在的蛋白质的性质或种类无关。例如，50mg/dL白蛋白应产生与50mg/dL任何其他蛋白相同的信号。人尿中正常的蛋白浓度范围为大约5～100mg/dL。各种各样的手段已被用于确定生物材料中的总蛋白浓度。在许多分析测定中，测定光学信号，如光谱的可见光区或紫外光区的吸收，其中该光学信号与样品中蛋白浓度成比例。然而，通常这些信号不为所希望地随样品中蛋白质的性质变化而并不单单与所存在的蛋白的含量有关。这些方法通常依赖于下列方式之一来产生能检测的光学信号1.蛋白质和Cu(II)的络合物，双缩脲反应在光谱的可见区产生可检测却很小的吸收。2.可测定蛋白质的芳香族氨基酸在光谱紫外区的吸收。3.可通过用含发色团的分子衍生特定的氨基酸测定蛋白质的含量，其中含发色团的分子可用其内在的吸收或荧光来定量。4.可使用能与蛋白非共价结合产生导致染料吸收光谱微扰的染料-蛋白质络合物的染料来确定样品中蛋白质的存在或含量。一些染料需要金属离子的存在，如钼或钨，在这种情况下，染料、金属离子和蛋白质形成的非共价络合物导致可用来确定样品中蛋白质的存在或含量的染料吸收光谱的微扰。5.蛋白质和染料对与Cu(II)的配位结合的竞争导致与蛋白质浓度成比例的吸收信号(Cu(II)/染料配位结合络合物具有与游离染料，即未与Cu(II)配位结合的染料不同的吸收光谱)。美国专利US4132528涉及基于双缩脲反应的蛋白质测定。`528专利中的干式分析单元包括双缩脲试剂Cu(II)和其螯合剂，例如，CuSO4和酒石酸或二者的络合物以及提供pH大于约12的缓冲液。当pH值大于12，存在于含水液体，如血清或脑脊液(CSF)中的蛋白质与双缩脲试剂相互作用时，二价形式的铜与蛋白质发生反应产生紫色。颜色强度与血清中蛋白含量成正比，并且蛋白质水平能够通过熟知的比色分析方法来测定。不幸的是，所述专利中干式载片单元具有比希望更低的灵敏度，即它们不能检测约200mg/dL或以下的蛋白质水平。美国专利US4786605描述了具有比`528专利中的单元更高的灵敏度的用于蛋白质定量的干式分析单元制品，其中它通过用预先制备的Cu(II)/吡啶偶氮染料配位结合络合物(或游离态Cu(II)与游离态的吡啶偶氮染料)代替双缩脲试剂。当蛋白水溶液加入到分析单元中时，二价铜离子被蛋白质从络合物中置换出来，并且Cu(II)/染料络合物的吸收曲线偏移未配位结合结合的染料的吸收曲线。因此，当蛋白质被加入时，Cu(II)/染料络合物的吸收峰与加入的蛋白量成比例地减少，并且从用含有已知浓度的蛋白的样品进行适当的校正出发，可用比色法测定液体样品中的未知的蛋白浓度。该专利教导说，那些单元具有极其良好的动态范围并且具有比基于双缩脲反应的单元高约30的灵敏度。然而，将`605专利的方法用于定量尿样中的蛋白却总会显示这一现象，即与用考马斯蓝溶液分析蛋白质浓度作为参考标准而获得的值比较，约10～20％的尿样出现令人无法接受的随机阳性偏差，也就是说，用`605专利方法所测定的某些患者尿样(约10～20％的样品群)的蛋白浓度高于用基于考马斯蓝的分析法所测得值。推测该随机阳性偏差是由于某些尿样中还原剂，如抗坏血酸的存在而造成的，其中这些还原剂导致Cu(II)和位于染料上的如硝基的可还原基团减少。因此，期望一种不易受上述测定方法缺陷影响的干式分析单元。业已熟知产生可检测的颜色变化的在酸性条件下的特定的指示剂染料与蛋白质和金属离子在溶液中的络合反应。如上所述，由于本文提到的原因，在溶液中能很好进行的分析测定方法可能不易适合于干式分析单元。特别希望不同的蛋白质与染料同等地反应来产生光学信号，其中这种信号与样品中存在的蛋白量有关且与蛋白质的性质无关。尿含有可变量的碳酸氢钠(高达约200mM)。假如未经稀释或样品的预处理(例如采用分子大小排阻技术)除去，尿样中高水平的碳酸氢钠可使大量的碳酸氢钠进入测定中而产生可能使得测定不可信或毫无用处的强碱状态，因为在低pH值(1.5～3.5)条件下发生染料-金属离子-蛋白质的相互作用和/或另外碳酸氢钠可通过金属离子的配位作用起干扰作用。需要提供不易受还原剂或碳酸氢钠存在影响的测定蛋白质的干式分析单元，其中它产生与存在的蛋白量基本相关的信号大小，即基本上(其中基本指适合于或可接受地用于特定蛋白质的测定用途，如尿样中总蛋白的测定)与蛋白质的性质无关的信号大小，并可被用来定量约5～约300mg/dL范围内的蛋白质，且不需要样品的预稀释，预浓缩，或除去所述干扰成分的预处理。出人意料地发现能够制备一种在存在钼酸根离子和包含丙烯酰胺的聚合物时包含指示剂染料和羟基羧酸化合物的适用于测定生物液体中蛋白含量或存在的干式分析单元。通过在存在本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种测定蛋白质的干式分析单元，所述单元包括：（Ａ）一层多孔铺展层；（Ｂ）一层或多层其它的层，包括：（ｉ）一种能与蛋白质和钼酸根离子反应而引起所述染料的光吸收或反射强度变化的染料；（ｉｉ）一种钼酸盐；和（ｉｉｉ）一种包含丙 烯酰胺的聚合物，其中所述染料，所述钼酸盐和所述包括丙烯酰胺的聚合物可一起存在于同一层中，或者以任何混合的形式或单独存在于所述单元的各层中；（Ｃ）一种载体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：T阿特尔，DB拉塔特，JC毛克，RC苏顿，W维伯，R温特科尔恩，J谢菲尔，
申请(专利权)人：奥索临床诊断有限公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]