VEGF-B/受体复合物及其应用制造技术

本发明专利技术公开了血管内皮生长因子－Ｂ（ＶＥＧＦ－Ｂ）和Ｆｌｔ－１酪氨酸激酶受体的复合物；这种ＶＥＧＦ－Ｂ／Ｆｌｔ－１复合物在检测ＶＥＧＦ－Ｂ或具有与ＶＥＧＦ－Ｂ基本上相同的结合细胞表面受体的亲和性的ＶＥＧＦ－Ｂ类似物中的应用，和／或在促进或拮抗ＶＥＧＦ－Ｂ介导的细胞应答中的应用；以及针对这种ＶＥＧＦ－Ｂ／Ｆｌｔ－１复合物的特异结合配对物例如抗体。（*该技术在2017年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
本专利技术涉及血管内皮生长因子-B(VEGF-B)和Flt-1受体的复合物，涉及使用这种复合物诱导或拮抗VEGF-B介导的细胞应答的方法，涉及用于鉴别VEGF-B和/或VEGF-B类似物的检测试剂盒，还涉及与VEGF-B/Flt-1复合物结合的分离的结合配对物如抗体。血管内皮生长因子(VEGF或VEGF-A；有时也称作血管通透因子或VPF)是PDGF家族的一种促血管生成生长因子，它通过两种内皮受体酪氨酸激酶(RTK)即Flt-1(也称作VEGFR-1)(Shibuya等，癌基因，5519-524(1990)；de Vrie等，科学，255989-991(1992)]和Flk-1/KDR(也称作VEGFR-2)起作用。这些受体似乎在内皮细胞生长和分化的调节以及在成熟内皮功能的保持方面起关键性作用。在血管系统的形成和保持以及生理性和病理性血管生成中需要VEGF和其高亲和性受体Flt-1和KDR/flk-1。胎盘生长因子(PlGF)是Flt-1 RTK的另一种配体。它也是PDGF家族成员并且与VEGF结构上相关，但是它的生物学功能目前尚不完全清楚。VEGF-B是一种内皮细胞的生长因子，它清楚地描述在Olofsson等的文章，“血管内皮生长因子B，一种新的内皮细胞生长因子”，美国科学院院刊，932576-81(1996)中。象VEGF和PlGF一样，VEGF-B是PDGF生长因子家族的一个成员，并与它们共享很大程度的结构相似性，如一组保守的半胱氨酸残基，这些半胱氨酸残基形成二硫键，参与该分子的同二聚化和异二聚化。但是，VEGF-B与VEGF仅有约40％-45％的序列相似性，与PlGF仅有约30％的序列相似性。现已发现VEGF-B与VEGF在多种组织中共表达，在心脏和骨骼肌组织中特别丰富。它促进内皮细胞的有丝分裂和增殖，并且似乎在内皮组织的生长和血管生成中起作用。VEGF-B在体外和体内均能增强低浓度的VEGF的促分裂原性活性。本专利技术基于下述发现，即VEGF-B能够与Flt-1受体酪氨酸激酶的胞外功能域结合形成生物活性的复合物，所述的复合物介导有用的细胞应答和/或拮抗不希望的生物学活性。本文中的VEGF-B的氨基酸序列请参照Eriksson等的PCT申请出版物WO96/26736中所述的人VEGF-B186的序列(Genbank数据库登录号U52819)。Flt-1的氨基酸或核苷酸序列请参照Shibuya等，癌基因，5519(1990)中所述的序列(EMBL数据库登录号X51602)。VEGF-B和/或VEGF-B类似物与Flt-1受体或其类似物的结合亲和性根据Lee等，美国科学院院刊931998(1996)中所述的程序进行测试。Olofsson等，美国科学院院刊932576-81(1991)描述了一种用于分析内皮细胞增殖的有用方法。根据本专利技术的一个优选方面，本专利技术涉及一种用于鉴别具有与VEGF-B基本上相同的结合细胞表面受体的亲和性的VEGF-B类似物的方法，所述的方法包括如下步骤(a)根据一种含有受体蛋白的样品，所述的受体蛋白选自(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链，或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并且由在严格条件下与Flt-1的核苷酸1-1293的核酸序列杂交的核酸所编码的多肽链；(b)将步骤(a)中的样品与候选的VEGF-B类似物接触；以及(c)检测候选的VEGF-B类似物与步骤(a)的受体蛋白之间的特异结合。据信VEGF-B与细胞表面的受体结合涉及VEGF-B二聚体与所述的受体结合，从而导致该受体的二聚化及该受体的自磷酸化，随后形成细胞内信号传导并在合适的条件下产生细胞应答如血管发生。含有受体蛋白的样品可以是例如在正常表达该受体的细胞的条件培养基中天然产生的可溶性Flt受体。经蛋白裂解而从细胞天然脱落的组织样品或组织液也可以用做受体样品。通过本专利技术这一方面鉴别的VEGF-B类似物可以是小分子，例如蛋白质或肽或者非蛋白类化合物如DNA或RNA。类似物也可包括与毒素和药物或放射性同位素连接的VEGF-B或衍生物(包括但不限于VEGF-B单体或二聚体的片段)，它们可以靶向肿瘤内皮细胞上表达和正调节的Flt-1。通过类似于Kim等，自然，362(6243)841-44(1993或Aiello等，新英格兰医学杂志，331(22)1480-87(1994)中所述的技术，这类分子可用于拮抗或抑制不希望的VEGF-B诱导的细胞应答如肿瘤诱导的血管发生、银屑病或视网膜病。分离VEGF-B/Flt-1复合物的一个程序涉及使用Flt-1受体和免疫球蛋白G(IgG)的融合蛋白，随后进行Sepharose A结合。替代使用Sepharose A的方法包括使用离子交换层析、凝胶过滤或亲和层析。含有受体/IgG融合蛋白的条件培养基可以与来自用编码VEGF-B配体或其类似物的DNA转染的细胞的条件培养基、来自天然表达该配体的条件培养基或含有候选的配体类似物的溶液相互作用。根据本专利技术的另一个优选的方面，本专利技术涉及一种用于鉴别具有与VEGF-B基本上相同的结合细胞表面受体的亲和性的VEGF-B类似物，所述方法包括下述步骤(a)提供一种含有能表达一种表面受体蛋白的细胞的样品，所述的表面受体蛋白具有结合VEGF-B的亲和性并选自如下一组(i)包含Flt-1的残基1-347所限定的氨基酸序列的多肽链或其VEGF-B特异性受体类似物；(ii)具有结合VEGF-B的亲和性并与Flt-1的残基1-347共享至少30％氨基酸相同性的多肽链；以及(iii)具有结合VEGF-B的亲和性并由在严格条件下与包含Flt-1的核苷酸1-1293序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；(b)将所述的细胞与候选VEGF-B类似物接触；以及(c)检测VEGF-B介导的细胞应答的诱导产生。这种可检测的细胞应答的例子包括内皮细胞增殖、血管发生、受体的酪氨酸磷酸化作用以及细胞迁移。表达细胞表面受体蛋白的细胞可以是天然表达该受体的细胞，或者可以是用受体转染而表达该受体的细胞。可将来自培养这种细胞的条件培养基通过Sepharose A柱或基质以固定化受体，或者在ELISA试验中，受体可以固定化在纤维素皿上或吸收在塑料上。然后将含有来自表达配体的细胞的条件培养基的第二种溶液通过这种固定化的受体。如果需要，配体可放射性标记从而便于通过放射性分析技术测定所结合的配体的量。这种分析可用于筛选Flt-1受体过量表达的病症，即通过检测与对照相比所结合的放射性增加而筛选。这一方法学也可用于筛选竞争性VEGF-B类似物的存在，即通过检测与对照相比所结合的放射性降低而筛选，这种降低表示试验中所用的放射性标记的VEGF-B配体与未经标记的潜在类似物之间有竞争。或者，前述分析可反过来固定化VEGF-B配体或候选的类似物并将固定化的配体与来自表达受体的细胞的条件培养基接触。根据本专利技术的另一方面，本专利技术涉及用于鉴别样品中VEGF-B或VEGF-B类似物的试剂盒，所述的试剂盒包括(a)一种适于接受样品并含有选自如下一组的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴别ＶＥＧＦ－Ｂ类似物的方法，所述的类似物的特征在于具有与ＶＥＧＦ－Ｂ基本上相同的结合细胞表面受体的亲和性，所述的方法包括如下步骤：（ａ）提供一种含有选自如下一组的受体蛋白的样品：（ｉ）包含Ｆｌｔ－１的残基１－３４７所限定的 氨基酸序列的多肽链或其ＶＥＧＦ－Ｂ特异性受体类似物；（ｉｉ）具有结合ＶＥＧＦ－Ｂ的亲和性并与Ｆｌｔ－１的残基１－３４７共享至少３０％氨基酸相同性的多肽链；以及（ｉｉｉ）具有结合ＶＥＧＦ－Ｂ的亲和性并由在严格条件下与包含Ｆｌｔ－１的核 苷酸１－１２９３序列的核酸杂交的核酸所编码的多肽链；（ｂ）将步骤（ａ）的所述样品与候选ＶＥＧＦ－Ｂ类似物接触；以及（ｃ）检测所述的候选ＶＥＧＦ－Ｂ类似物与步骤（ａ）的受体蛋白之间的特异性结合。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：埃扎考佩莱宁，余吉甘吉，凯里阿利塔罗，比吉塔奥洛夫松，乌尔夫埃里克松，
申请(专利权)人：路德维格癌症研究所，赫尔辛基大学许可贸易公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]