基于β-连环蛋白/转录因子相互作用诊断/治疗疾病的组合物和方法技术

本发明专利技术用于涉及诊断和／或治疗由不希望有的细胞生长引起的疾病（优选癌症）的方法和组合物，包括诊断细胞中稳定化Ｂ－连环蛋白，或用破坏或改变由β－连环蛋白／转录因子组成的复合物的形成的化合物处理细胞，其中转录因子是Ｌｅｆ／Ｔｃｆ家族的成员。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术一般涉及人类疾病领域，更具体地涉及以影响β-连环蛋白与某些转录因子相互作用的物质成分的鉴定为基础，治疗和诊断涉及不希望有的细胞生长的疾病。一段时间以来，已知多种癌症至少部分是由某些被称为“原癌基因”的正常基因的突变引起的。原癌基因参与调节正常细胞的生长，目前才逐渐明白其调节的方式为分子水平。如果不能及时地检测和治疗癌症，突变的原癌基因或被称为“癌基因”的致癌基因会破坏正常细胞的生长，最终导致生物体死亡。在正常细胞或癌细胞的生长过程中，原癌基因或癌基因分别通过调节或试着调节正常细胞或癌细胞生长的生长调节蛋白来相抗衡。这种蛋白质被称为“肿瘤抑制蛋白”，它包括BRCA1，p53，成视网膜细胞瘤蛋白(Rb)，腺癌结肠息肉病蛋白(APC)，Wilm肿瘤1蛋白(WT1)，神经纤维瘤1型蛋白(NF1)和神经纤维瘤2型蛋白(NF2)。肿瘤抑制蛋白与细胞中调节其活性的其它蛋白质的相互作用是生物医学深入研究的领域。不断有证据表明b-连环蛋白与某些类型的癌症相关，并且是非洲爪蟾属(Xenopus)和果蝇属(Drosophila)发育中重要的信号蛋白(1)。关于后者，建议的途径由wnt-1/无翼受体起始，该途径包括β-连环蛋白的翻译后稳定化，导致其在胞质和核中积累。据认为，b-连环蛋白在核中与LEF/TCF家族转录因子相互作用，因此直接调节靶基因的表达(2)。wnt-1原癌基因也使哺乳动物细胞培养物中的b-连环蛋白稳定化，当在小鼠乳腺组织中表达时还可促进肿瘤形成(3)。当在含有缺损APC的结肠癌细胞中异位表达时，APC肿瘤抑制基因可下调过量的细胞内b-连环蛋白，这一观察结果支持癌症中b-连环蛋白信号传递的潜在作用(4)。b-连环蛋白转换的调节机制需要蛋白质的氨基末端区域。此序列的缺失，或其中4个丝氨酸/苏氨酸残基的突变导致b-连环蛋白的积累，因而激活其在信号传递中的作用(5，6，7)。然后，可以想象使b-连环蛋白稳定化的突变可导致肿瘤发生时失去细胞生长控制。目前还不知道这些突变的鉴定，也不知道稳定化的β-连环蛋白如何影响细胞生长。本专利技术的第一个目的是描述编码稳定化的β-连环蛋白的分离的相关核酸序列的家族。本专利技术的第二个目的是描述由β-连环蛋白和某些转录因子组成的基本上纯的蛋白质复合物，所述复合物可影响细胞生长。本专利技术的第三个目的是描述由β-连环蛋白和某些转录因子组成的基本上纯的蛋白质复合物，所述转录因子优选为Lef/Tcf家族的转录因子。本专利技术的第四个目的是描述由β-连环蛋白和某些转录因子组成的复合物，所述转录因子优选为Lef/Tcf家族的转录因子的Lef，所述复合物可影响细胞生长。本专利技术的第五个目的是描述影响β-连环蛋白与某些转录因子相互作用的物质成分的鉴定方法，所述转录因子优选为Lef/Tcf家族的转录因子。本专利技术的第六个目的是描述使用影响β-连环蛋白与某些转录因子相互作用的物质成分来诊断或治疗疾病的方法，所述疾病优选为涉及不希望有的细胞生长的疾病，包括癌症，所述转录因子优选为Lef/Tcf家族的转录因子。通过阅读下列说明书中本专利技术各个方面的描述，本专利技术的这些和其它目的对于本领域技术人员而言将是显而易见的。下文的图，详细描述和实施例将更详细地解释本专利技术的上述和其它方面。附图说明图1.分析黑素瘤细胞系中的b-连环蛋白和APC。(A)对得自所示细胞系的蛋白质-等量的总细胞裂解物进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和免疫印迹(13)。水平切下印迹，用抗-APC2(顶端)或抗-b-连环蛋白(底端)显色印迹。用125I-A蛋白显色b-连环蛋白印迹，每个泳道下面示出每个b-连环蛋白带的每分钟计数(CPM)。(B)从蛋白质-等量的细胞裂解物中免疫沉淀APC，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析沉淀物中的APC和b-连环蛋白(13)。左边的值表示蛋白质标准的位置和以千道尔顿计的分子量，NHEM表示正常的新生儿黑素细胞。所有其它细胞系得自人黑素瘤(16)。(C)对得自各个裂解物的大约800mg的总蛋白质进行大小排阻层析，通过SDS-PAGE和免疫印迹分析级分中的b-连环蛋白。顶端示出总裂解物(L)和柱级分(FRX.)的数目，箭头表示蛋白质标准的洗脱位置。为具有较低水平的总b-连环蛋白的细胞系提供较长时间的暴露。图2.通过WT APC的异位表达下调b-连环蛋白。用编码人WT APC的质粒瞬时转染928mel和888mel细胞，48小时后，固定细胞，并用抗-APC(左)和抗-b-连环蛋白(右)共显色(18)。图3.b-连环蛋白的脉冲追踪分析。(A)用35S-甲硫氨酸脉冲-标记黑素瘤细胞，在所示时间内用未标记的甲硫氨酸追踪上述细胞，然后裂解该细胞(20)。免疫沉淀β-连环蛋白，通过SDS-PAGE和荧光显影术分析该蛋白。在各组实验对象的左边b-连环蛋白带的位置处示出细胞系，DN表示1088mel细胞中氨基末端截短形式的b-连环蛋白的位置。(B)对稳定表达野生型b-连环蛋白(wt)或ser37ala突变体(S37A)的ATT20细胞系进行脉冲追踪分析(20)。(C)用编码APC羧基末端(APC3)或中心(APC25)片断和b-连环蛋白WT或ser37ala突变体的质粒瞬时共转染SW480细胞(20)。APC25下调b-连环蛋白，而APC3不下调b-连环蛋白(4)。图4.LEF1与b-连环蛋白的共免疫沉淀。从约600mg所示细胞裂解物的总蛋白质中免疫沉淀β-连环蛋白。通过SDS-PAGE和免疫印迹分析沉淀物中的b-连环蛋白和LEF1(13)。本说明书中提及的所有文献和专利申请都列入本文作为参考，它们被引用的程度相同，就好象每篇文献或专利申请被具体地和单独地列入本文作为参考一样。定义一开始就应指出，除非另有定义，本文所用的所有科技术语的含义与本专利技术所属领域的技术人员通常所理解的含义相同。本文所用的命名和下文所述的实验室方法是本领域众所周知的和常用的。重组核酸方法，多核苷酸合成和微生物培养及转化(如电穿孔，脂转染法)中使用的是标准技术。一般根据厂商的具体说明进行酶促反应和纯化步骤。一般根据本领域的常规方法和贯穿本文提供的多种一般性的参考文献(一般参见Sambrook等，分子克隆实验室手册，第2版(1989)，冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约，列入本文作为参考)进行技术和方法。本文所用的命名和下文所述的分析化学，有机合成化学和药物配制实验室方法是本领域众所周知的和常用的。化学合成，化学分析，药物配制和传递以及患者的治疗使用的是标准技术。在描述本专利技术β-连环蛋白或转录因子选定的具体实施方案的式中，尽管经常未特别地显示出氨基和羧基末端基团，但应理解除非另有特别说明，它们应呈现在生理pH值下所采取的形式。因此，应理解生理pH下的N末端H2+和C末端O-是存在的，但在具体实施例或通式中不必特别地指出和显示。根据标准用法和常规，在本文所用的多肽标志中，分子的左手端是氨基末端，右手端是羧基末端。当然，本专利技术的化合物中也包括碱和酸加成盐，包括那些在非生理pH值下形成的盐。本文所述的氨基酸残基优选为“L”异构形式，20个常规氨基酸，非天然氨基酸，如a，a-分布的氨基酸，N-烷基氨基酸，乳酸和其它非常规氨基酸的立体异构体(如D-氨基酸)也本文档来自技高网...

【技术保护点】
分离的基本上纯的稳定化β－连环蛋白或其片断。

【技术特征摘要】
...

【专利技术属性】
技术研发人员：P波拉凯斯，B鲁宾菲尔德，
申请(专利权)人：昂尼克斯药物公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]