生物量浓度的检测方法和仪器技术

本发明专利技术以Ｍａｘｗｅｌｌ－Ｗａｇｎｅｒ效应为基础，通过测量发酵液在无线电频率范围内的电容率分布，实现了对酵母浓度的在线实时检测。仪器用参照电极技术克服了发酵条件变化对测量结果的影响。电极直接插入发酵液中并能用蒸汽灭菌，电极寿命长且不感染和污染发酵物。仪器测得的是活酵母的浓度。本仪器既可单独使用，也能与其他部件组成反馈控制系统，实现对发酵过程的自动控制。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术提出了对酵母浓度(生物量浓度)进行在线实时检测的新方法并制造出了基于这种方法的仪器。本专利技术基于Maxwell-Wagner效应，即微生物的存在会影响或改变发酵液的电容率这一客观事实。仪器用参照电极技术克服了发酵条件变化对测量结果的影响；电极(传感器)直接插入发酵物中且能承受高温蒸汽灭菌条件。本仪器的优点是不用取样就能对发酵器中的酵母浓度进行连续的测量，而且测得的是活的酵母数。本仪器既可单独使用，也可以与其他部件结合组成反馈控制系统。本仪器在生化制药，食品发酵，啤酒酿造，污水检测处理等工业领域里有很好的推广应用前景。近年来，现代高新生物技术有了飞速的发展，人们有目的的去培育新的菌种，以生产新的对人类有用的物质，例如抗生素，氧基酸，维生素和具有生物活性的蛋白质等。制药(如青霉素，链霉素等)，酿酒(如葡萄酒，啤酒等)都要经过发酵过程。影响发酵过程的因素很多，如发酵液的成分和浓度，溶解氧含量，温度，PH值，搅拌速度，酵母的种类，活性和浓度等等。在上述因素中，酵母浓度是最重要的工艺参数，因为在一定条件下，发酵的得率与酵母浓度密切相关。因此酵母浓度的实时在线检测，对了解和控制发酵进程，提高产品的质量具有重要的意义。但是直到现在人们还没有研制出符合要求的仪器，这种仪器应能对生物量进行准确的在线实时检测，而不改变或破坏原微生物系统的工作状态。我们这里所说的实时检测，意思是仪器的读数应该是此时此刻的生物量浓度，而不是几十分钟或几个小时之前的数值。通过微生物的繁殖生长过程，在生物反应器中生产有用物质的过程，与在化学反应釜中通过催化作用生产化学物质的过程有很大的不同。因为在生物反应器中酵母的数目每时每刻都在发生变化。生物量浓度的检测对任何发酵过程都是非常重要的，也是科学家和工程师们非常感兴趣的研究课题。但是直到今天，人们还没有研制出满足工业现场要求的测量仪器。生物量的传统测量方法是高线的，主要有干重法，光密度法和亚甲基蓝染色法等。目前人们把干重法看成是一种参照方法，因为用其他方法测得的生物量一般都要与干重法测得的数值相对照。但是Jens Nielsen教授认为，把干重法作为参照方法(或基准方法)是不适宜的。因为干重法是基于地球引力(重力)的方法，它有很多缺点。首先，工业发酵物中一般含有多种颗粒状的有机物和无机物，他们跟微生物混在一起，很难把它与微生物分开。其次，活的酵母和死的酵母对测量结果都有贡献，而我们希望得到活酵母的数目，因为只有活的酵母具有繁殖能力。虽然干重法有这些缺点，但由于找不到其他好的参照方法，所以目前人们把干重法作为参照方法。用本专利技术提出的方法测得的结果也与用干重法测得的结果作了对比。但是必须指出用本专利技术的方法和其他方法所得的结果有时更准确的表征了酵母浓度，尽管这些结果与干重法的数值有较大差异，特别是在批量发酵过程中更是如此光密度法(Optical Density，即O D)是又一种参照方法。当用一定波长的光线照射发酵液时，酵母和颗粒状悬浮物对光有反射和散射作用。反射光和散色光与生物量之间有一定的对应关系，根据这个原理可以制成生物量检测仪。但此类仪器的读数易受发酵流的颜色，浊度，颗粒状悬浮物的影响，也不能排除死酵母的影响，这类仪器难以用来测量淤泥状发酵物。此外还有基于荧光原理的仪器，此类仪器不能用来测量盘尼西林等发酵物，因为盘尼西林是荧光携带者。为了检测活酵母的数目和酵母的活性，人们通常用细胞计数器或用亚甲基蓝染色，然后用显微镜观察计数。但这种方法要做多次稀释，会产生很大的误差。用这种方法得到的不是此时此刻的生物量，而是几十分钟或几个小时之前的数值。而有些菌体繁殖很快，在一个小时内会增加一倍以上。对于杆状细菌或丝状细菌，有时他们会缠在一起。在这种情况下，光密度法和亚甲基蓝染色法就显得无能为力。当超声波通过发酵液时，基幅度被衰减，其传播速度会有所改变，据此原理可制成生物量测量仪。但此类仪器易受发酵液成分变化，汽泡，温度变化，粘稠度的影响。酵母的存在会影响发酵液的电特征，有些学者试图通过阻抗(或导纳)测量法测量生物量浓度和研究酵母生理状态的变化。虽然人们作了很多工作，但此法的研究还远远没有达到能做实际应用的程度。因为即便在实验室条件下，发酵液的阻抗也会出现复杂的变化。我们发现当发酵液的成分发生较大变化时，特别是发酵液中离子的浓度发生较大变化时，阻抗测量法的准确度是很差的。上述方法都是高线测量法，都要从发酵罐中抽取样品，在取样过程中极易带进杂菌而使实验半途而废。采用高线方法的另一个缺点是，人们不能用这种方法来对发酵过程进行自动控制。综上所述，Jens Nielsen，B.H.Junker等世界知名学者认为，直到现在人们还没有制造出满足要求的在线检测仪器，该仪器能对发酵过程中的生物量浓度进行准确的实时测量。本专利技术的目的是提出一种新方法，制造一种新仪器，用该仪器能对生物量浓度进行在线实时测量和控制，而不改变或破坏生物反应器的工作状态。本专利技术提出的方法和制作的仪器，主要用于对发酵液中的酵母浓度进行在线实时测量。本仪器可以单独使用，也能与其他部件一起组成反馈控制系统，对发酵过程进行自动控制。本专利技术的理论依据是Maxwell-Wagner效应(或称为Maxwell-Wagner分布)，即发酵液的电容率对于酵母浓度和测量频率的依赖性。微生物的存在会影响发酵液的电特性，这个现象上个世纪末人们就认识到了。本世纪初Fricke通过测量红血细胞在声频和无线电频率下的介电特性，算出了细胞膜的厚度为分子数量级，而Clarke及其同事实现了一种装置，该装置通过测量含微生物溶液的导磁性来确定发酵液中的生物量浓度。从电学的角度来说，一切物质(包括发酵液)的电特性都可以用电导率和电容率来表征。发酵液的电导率可定义为其传导电荷的能力；而发酵液的电容率可定义为其储存电荷的能力。设酵母的形状是球形的，用r表示酵母的平均半径(单位为m)；Cm为细胞膜单位面积的电容(单位为F/m2)；ε0是真空中的电容率(单位为F/m)，其值大约等于8.85×10-12F/m)；P是体积系数，它是所有酵母菌的体积与发酵液体积的比，P是一个远远小于1的数，无量纲；ε∞是发酵液在很高频率下(相对于测量频率而言)的相对电容率(无量纲)；εf是发酵液在测量频率下的相对电容率(无量纲)。则在一定测量频率范围内(o＜f＜f∞)，发酵液的相对电容率可表示为εf＝9prcm/4ε0+ε∞(1)水的相对电容率在60到85之间，其典型值是78。随着温度和电导率的不同，εf会有所变化。如果测量电压比较低，水的电容率几乎与测量信号频率无关。如果把水放入发酵器中，其电容率受其中溶解的气体和非细胞物质的影响较小，当测量含有酵母的发酵液的电容率以确定生物量时，水的电容率可作为参照信号。图1画出了放了啤酒酵母的麦芽汁在100KHz～10MHz频率范围内电容率的分布曲线。从图中可以明显地看出a。对于酵母浓度一定的麦芽汁，当测量频率由低到高逐渐增加时，电容率逐渐减小，最后趋向于纯麦芽汁(基质)的值。我们说发酵液的电容率具有频率依赖性，即电容率是频率的函数；b。如果测量信号频率不变，发酵液中酵母的数目越多，测得的电容率越大，这就是说发酵液的电容率具有酵母浓度的依赖性或电容率是酵母本文档来自技高网...

【技术保护点】
本专利技术以Ｍａｘｗｅｌｌ－Ｗａｇｎｅｒ效应为基础，通过测量发酵液在无线电频率下的电容率分布，实现了酵母浓度的在线实时检测。本专利技术使用参照电极技术，克服了发酵液成分变化．离子种类和浓度改变对测量结果的影响。为了消除电极极化对测量结果的影响，本发采用了四电极技术。本专利技术的电极直接插入发酵罐中，电极能够用高温蒸汽灭菌，电极寿命长且不感染和污染发酵物。本专利技术不经采样就能对发酵液中的酵母浓度进行连续的测量，避免了采样可能对发酵物造成的感染。本专利技术测得的是活酵母数。本专利技术不但可用来测量酵母菌，还可用来测量细菌．植物细胞和动物细胞（如血细胞），也适用于测量杆状细菌和丝状细菌。用本专利技术不但能测量酵母浓度的变化，还可用来研究酵母生理状态的变化。本仪器既可以单独使用，也可以与其他部件一起构成反馈控制系统，实现对发酵过程的自动控制。 本专利技术所提出的以Ｍａｘｗｅｌｌ－Ｗａｇｎｅｒ效应为基础，通过测量发酵液在无线电频率范围内（１００ＫＨＺ－１０ＭＨＺ），发酵液的电容率（即介电系数）的变化来测量生物量浓度（包括酵母浓度．细菌浓度．植物细胞和动物细胞浓度）的方法。通过在发酵液中放置一对电极，然后测量这对电极间的电容来确定电容率的方法。通过测量流过电极的电流Ｉ，两电极间的电压Ｖ以及Ｉ、Ｖ间相位差φ来计算Ｃ的方法。...

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：王劲松，王贻俊，
申请(专利权)人：王劲松，
类型：发明
国别省市：88[中国|济南]