肺炎衣原体表面蛋白制造技术

本发明专利技术涉及对来自人呼吸道病原体肺炎衣原体的、编码大小约为８９－１０１ ｋＤａ和５６－５７ｋＤａ（较佳的约为８９．６－１００．３ｋＤａ和约为５６．１ｋＤａ）的表面膜蛋白的基因家族成员的鉴定。本发明专利技术涉及新的ＤＮＡ序列，对应蛋白质的推定的氨基酸序列，以及该ＤＮＡ序列和蛋白在病理学和流行病学上诊断由肺炎衣原体引起的感染的用途，以及作为疫苗组分的用途。（*该技术在2018年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及人呼吸道病原体肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的、编码大小约为89-101kDa和56-57kDa(较佳的约为89.6-100.3kDa和约为56.1kDa)的表面(surfaceexposed)膜蛋白的基因家族成员的鉴定。本专利技术涉及新的DNA序列，其对应蛋白质的推定的氨基酸序列，以及该DNA序列和蛋白在病理学和流行病学上诊断由肺炎衣原体引起的感染和作为疫苗组分的用途。总体背景肺炎衣原体是专性胞内细菌(Christiansen和Birkelund(1992)；Grayston等人，(1986))。它具有和革兰阴性菌一样的细胞壁结构，具有外膜、周质间隙和胞质膜。用洗涤剂十二烷基肌氨酸钠可以纯化革兰阴性菌的外膜。该组分被命名为“外膜复合物(OMC)”(Caldwell等人，(1981))。肺炎衣原体的COMC(衣原体外膜复合物)含有四组蛋白质经SDS-PAGE测得的98kDa高分子量蛋白、62/60kDa的富含半胱氨酸的外膜蛋白2(Omp2)的两条条带、38kDa的主要外膜蛋白(MOMP)、以及12kDa的低分子量脂蛋白Omp3。Omp2/Omp3和MOMP蛋白存在于所有衣原体种类的COMC中，已经从沙眼衣原体(C.trachomtis)、鹦鹉热衣原体(C.psittaci)和肺炎衣原体中克隆出这些基因。然而编码肺炎衣原体COMC中98kDa蛋白的基因还未被鉴别或克隆。肺炎衣原体血清学和鉴定的现有状况肺炎衣原体是一种专性胞内细菌，属于衣原体属，该衣原体属可以分为四种沙眼衣原体、肺炎衣原体、鹦鹉热衣原体和C.pecorum。四个种类的共同之处是它们在细胞内的专性生长，且它们具有胞外感染性颗粒(原体，EB)和胞内复制形式(网状体，RB)的双相生命周期。另外，衣原体种类的特征是在人类感染中高度免疫原性的共同脂多糖(LPS)表位。沙眼衣原体引起人眼感染(沙眼)和生殖感染。鹦鹉热衣原体是一类可变的动物病原体，其中的禽株偶尔会感染人并引起严重的肺炎鸟疫。第一个肺炎衣原体分离物从眼感染获得，但是它被归类为非典型(non-typable)的衣原体。在芬兰肺炎流行性爆发时，发现患者在衣原体属特异性测试(淋巴肉芽肿皮肤试验抗原测试)中有阳性反应，且患者表现非典型的衣原体分离物的滴度升高。在西雅图上呼吸道感染爆发时获得了类似的分离物，该衣原体分离物归类为一种新的种类肺炎衣原体(Grayston等人，1989)。另外，有人指出肺炎衣原体涉及到粥样动脉硬化病变发展和刺激性支气管哮喘(Kuo等人，1995)。这两种病症被认为是由于慢性感染或过敏反应或两者共同引起的。肺炎衣原体感染的诊断诊断肺炎衣原体引起的急性呼吸道感染是困难的。对患者样品的肺炎衣原体培养是不敏感的，甚至是选择合适的组织培养细胞未分离时也如此。因此Campbell等人(1992)开发出一种肺炎衣原体特异性的聚合酶链反应(PCR)。尽管在一些研究中已经用该PCR方法检测了肺炎衣原体，但是该方法是否适用于所有的临床场合仍有争论。其原因是，急性呼吸道感染中携带肺炎衣原体的细胞还未确定，且预计会有慢性携带状态，只是不知道它们存在于哪些器官和细胞中。另外，PCR测试很难进行，因为这些细菌的产量很低，且患者样品中存在抑制性的物质。因此，开发出敏感的、特异性的血清型诊断方法来检测急性和慢性感染是将会有很大价值。衣原体感染的血清学诊断方法目前是基于属特异性的测试(如淋巴肉芽肿皮肤试验抗原测试和ELISA(测定LPS的抗体))，或是更特异性的种属测试(用微量免疫荧光法(Micro-IF)测定针对纯化的EB的抗体)(Wang等人，1970)。然而，微量免疫荧光法要用显微镜来读数，且为了确保有正确的读数，必须将结果与用作抗原(由于与共有的LPS表位的交叉反应抗体)的沙眼衣原体的结果比较。因此，正如Kuo等人(1995)年所表述的，“本领域中主要需要一种用于临床实验室的测试感染的迅速、可靠实验室方法”，本领域迫切需要开发出用于针对肺炎衣原体的种特异性诊断方法。另外，肺炎衣原体可能涉及粥样动脉硬化和支气管哮喘显然也使得开发有效的疫苗有正当的理由。专利技术详细公开本专利技术的目的是提供有效诊断肺炎衣原体感染的方法以及开发出有效抵抗该微生物感染的疫苗。因此，本专利技术涉及种特异性的哺乳动物(如人)体内肺炎衣原体感染的诊断测试方法，所述测试是根据对抗体进行检测，该抗体针对大小约为89-101kDa和56-57kDa(较佳的约为89.6-100.3kDa和56.1kDa)(推导的氨基酸序列的大小范围为100.3至89.6，除大小为56.1的Omp13外)的表面膜蛋白，或是基于对编码该蛋白或其变体或亚序列的核酸片段进行检测。本专利技术还涉及本专利技术蛋白的氨基酸序列，其变体和亚序列，以及编码这些蛋白或其变体或亚序列的核酸片段。本专利技术还涉及针对本专利技术蛋白的抗体。本专利技术还涉及本专利技术的核酸片段和蛋白在诊断肺炎衣原体以及抗肺炎衣原体疫苗中的用途。在本专利技术公开前，只有很少的肺炎衣原体基因被测序。它们主要是编码已知的沙眼衣原体同系物(MOMP、Omp2、Omp3、Kdo转移酶)的基因、热休克蛋白基因GroEl/Es和Dnak(一种核酸酶P同系物)和编码功能未知的76kDa蛋白的基因。为何至今只有如此少的基因被克隆的原因是因为从宿主细胞纯化后能获得的肺炎衣原体的产量非常低。在这种纯化后，DNA必须从EB中纯化出，而在此步骤肺炎衣原体DNA容易被宿主细胞DNA污染。除了这些固有的困难外，培育肺炎衣原体并用DNA技术产生很少数量(几个μ)DNA的表达文库非常困难。自1993年起已经知道(Melgosa等人，1993)，98kDa的蛋白存在于肺炎衣原体的OMC中。尽管Melgosa提到98kDa的蛋白条带是肺炎衣原体OMC的一部分，但是其基因序列以及推导的氨基酸序列一直未被确定。该文中只描述了用SDS-PAGE大致分离出的肺炎衣原体蛋白的条带。然而，在本专利技术前，编码该蛋白的基因一直未被确定。发现98kDa蛋白与人血清只有很弱的反应或没有反应(Campbell等人，1990)，在本专利技术者的工作之前，还没有认识到89-101kDa蛋白是表面外露的或它们实际上有免疫原性。在该报道中描述了许多人血清样品能与SDS-PAGE中迁移至98kDa的肺炎衣原体蛋白反应。该蛋白没有进一步作特性分析，因此它与本申请没有冲突。Halme等人1997年描述了92-98kDa肺炎衣原体蛋白中存在人T细胞表位。从总衣原体蛋白的SDS-PAGE中洗脱出该蛋白，但是该蛋白的身份没有被确定。用抗体来筛选表达文库是克隆编码蛋白的抗原性部分基因片段众所周知的方法。然而，由于患者的血清没有表现出与98kDa蛋白有明显的反应，因此不可能用患者血清来克隆该蛋白。已知由专利技术者获得的单克隆抗体能与肺炎衣原体表面上的构象表位反应，它们还与肺炎衣原体OMC反应(经免疫电子显微镜测得)(Christiansen等人，1994)。另外，98kDa蛋白是肺炎衣原体OMC中唯一未知的蛋白(Melgosa等人，1993)。本专利技术者选择采用非常规的步骤来克隆编码至今未知的98kDa蛋白的基因纯化肺炎衣原体OMC，在免疫接种前用SDS处理抗原破坏免疫原本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种鉴定哺乳动物如人感染肺炎衣原体的种特异性诊断测试方法，所述测试方法包括检测患者体内或患者样品内是否有针对肺炎衣原体外膜的一种或多种蛋白的抗体存在，所述蛋白的分子量为１００．３－８９．６ｋＤａ或５６．１ｋＤａ，或检测编码所述外膜蛋白的核酸片段是否存在。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：斯万德伯克伦德，根纳克里斯蒂安森，K克努森，AS赫布斯加德彼泽森，P迈金迪，
申请(专利权)人：洛克诊断APS，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]