中密度DNA(基因)芯片制作方法技术

本发明专利技术公开了一种中密度ＤＮＡ（基因）制作方法。它是先将待检测的ＤＮＡ序列找出，并进行探针的合成，合成后在５’末端进行活性基团的修饰，然后启动ＤＮＡ点样装置，将ＤＮＡ送至指定的位置，并使点样针与玻片接触；在一组玻片的相应位置循环点样，制作１００～１０００探针／ｃｍ↑［２］的ＤＮＡ芯片。当一次ＤＮＡ样本点样完成后，触发点样针淋洗干燥系统。在完成ＤＮＡ点样后，可以进行ＤＮＡ的杂交，扫描获得的图像。该方法操作简便，成本低廉。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术是涉及中密度DNA(基因)芯片的制作方法。现有基因芯片制作技术都处在研究之中，至今尚无成熟的技术或产品问世。目前正在研究的芯片制作技术主要分两大类，即激光光刻/光学导向合成技术和三维机器人DNA点样系统。激光光刻/光学导向合成技术以美国Affymatrix公司为唯一代表。Affymatrix公司是光刻导向合成芯片制作技术的始创者。该技术通过激光制作细微光孔的光学屏蔽板，然后在利用光孔的导向作用直接指导在芯片上的DNA寡核苷酸探针合成，(http//www.affymatrix.com)。该技术可以获得密度很高的DNA寡核苷酸探针点阵芯片，但该技术需要昂贵的专用激光设备，制作过程复杂、时间长、质量不易控制，特别是在光导合成过程中对特定碱基的选择还没有达到足够的特导性。另外由该技术制作的芯片，也必须由专用配套的激光扫描检测设备进行检测。三维机器人DNA点样系统由美国斯坦福大学首创并在1998年3月在网络上公布(http//cmgm stanford.edu/pbrown/)，其后世界上其它少数实验室也开始跟进，然而至今也未见成熟推向市场的产品和系统的制作技术。该技术操作的一般规律是先合成5’氨基标记的DNA寡核苷酸探针，然后通过泉水笔尖蓄水的原理将DNA探针传递到有醛基修饰的玻片上。此DNA传递过程由X、Y、Z轴线性运动平台组成的三维机器人完成。在软件的控制下，可以将DNA探针传递到指定的位置。目前由斯坦福大学制作的DNA点样系统，虽然可以在一张玻片上排列上万个基因探针，但是该仪器是由市场购进的运动组件模块组装而成。机器大而笨重，组装价格昂贵，一般均需3万美元以上。更主要的是该机器打印针清洗、干燥系统设计不合理，需要大量的清洗液。由于机器笨重，操作烦琐，不易控制，极易造成损坏。本专利技术的目的是提供一种中密度DNA(基因)芯片的制作方法。为了达到上述目的，本专利技术采取下列措施中密度DNA(基因)芯片制作方法它包括先将各种待检测的DNA序列找出，并进行探针的合成，合成后在5’末端进行活性基团的修饰，采用点样机点样，其特征在于所说点样机点样是在一块平板上，顶部安置X轴的直线驱动装置，在微型步进电机的控制下驱动固定在X轴上的Y轴作左右来回移动，而在Y轴也在微型步进电机的控制下以相同的分辨率步距驱动连接在Y轴上的DNA样本打印装置和打印针作前后来回移动，这样，两个微型步进电机和DNA打印头分别在驱动程序的控制下，精确地作三维空间的定位和打印，将DNA送至指定的位置，并使点样针与玻片接触，在每一片玻片上相应位置点样，每次循环点样后点样针经清洗、干燥装置作清洗、干燥处理。本专利技术的优点1.仪器设置简单，体积小。无论是激光刻蚀、屏蔽技术还是三维机器人技术，均需要复杂的专用设备，装置成本在30000美元以上。三维机器人技术，机器重量超过500Kg，对于搬运、维修都不方便。本专利技术中密度DNA芯片制作方法，利用现成设备加以改造，成本不足1000美元，而且虽然体积小巧，DNA点样密度仍达到100～1000/cm2，仍然可以一次制作50张芯片。2.独特的DNA点样针清洗、干燥装置。本专利技术的DNA点样针的清洗和干燥装置，采用负压抽吸喷淋的原理和风干的原理，将清洗、干燥装置整合在不足1X1X2cm的装置中，大大减轻了仪器的重量、减少清洗液的用量。同时采用针控负压启动喷淋装置。只有在打印针接近淋洗装置时，喷淋系统才开始工作，与恒流系统相比，可节省90％以上的淋洗液。该装置制作简单，成本低廉，因此便于随时更换。3.DNA点样针的设计本专利技术点样针选用亲水性陶瓷材料制作，具有成本低，易于清洗和易于维护。而现有技术采用泉水笔刻槽吸纳原理制作点样针，制作工艺要求高，成本高，一根针需300美元，而且有容易堵塞，针尖易损等缺点。4.操作简便本专利技术设计的打印驱动软件，具有随机选择打印位置、调节DNA斑点的间距、调节打印针的清洗、干燥和点样时间、位置校正、标签打印、打印预览等多种功能，不需特别的学习即可进行操作。5.中密度芯片适用于非激光检测装置，降低了对激光扫描装置的依赖性。这是该专利技术为普及推广DNA芯片应用的主要目的。DNA芯片的专利技术最终是为了更广泛的应用，激光扫描装置的高成本是阻碍DNA芯片应用的最大的障碍。本专利技术的中密度DNA芯片制作技术，具有直径200μm的DNA斑点，可以直接被诸如CCD检测装置所检测。下面结合附图、实施例作详细说明附图说明图1是DNA芯片制作和检测流程图；图2是DNA点样装置的结构示意图；图3是DNA点样针清洗、干燥装置结构示意图；图4是陶瓷材料DNA点样针结构示意图。为了便于理解，先介绍DNA芯片制作和检测的流程(图1)。在进行DNA探针点样之前，必须先作DNA寡核苷酸探针合成和末端活性基团标记，这样可以制成DNA探针1、DNA探针2、DNA探针3……DNA探针N。DNA探针的数目依具体的检测项目和应用而定。完成DNA探针的合成之后，启动中密度DNA点样装置，在芯片制作控制程序的控制下进行DNA探针的打印。通过DNA打印针每次取一个DNA探针如DNA探针1，通过三维定点传递装置将DNA探针传递到指定的点样位置。完成一次打印后，荷样打印针至清洗装置清洗、干燥，进行下一轮DNA探针的点样，依次类推，直至所有DNA探针传递点样完毕。作为DNA探针的支持系统，可选择氨基或醛基反应性基团修饰的玻片，选择何种玻片主要依据标记DNA探针的活性基团而定。在检测时，首先进行被检测DNA样本的抽提、纯化，然后作逆转录，DNA荧光素标记，再进行目标DNA与芯片探针杂交，然后进行共聚焦激光扫描显微镜或芯片专用扫描仪扫描，最后进行实验结果的采集和图像计算机分析。本专利技术中的DNA点样设备包括由微型步进电机驱动的X、Y和Z轴组成的三维空间运动系统作指定的空间定位和DNA的定点传递。利用平板式绘图仪进行改装并增加点样针的自动清洗、干燥系统以及可变的时间控制。在一块约50×40cm的平板上。顶部安置X轴的直线驱动装置1，在微型步进电机的控制下可以以分辨率0.25μM的步距驱动固定在X轴上的Y轴2作左右来回移动，而在Y轴也在微型步进电机的控制下以相同的分辨率步距驱动连接在Y轴上的DNA样本打印装置3和打印针7作前后来回移动。这样，两个微型步进电机和DNA打印头可以分别在自编驱动程序的控制下，精确地作三维空间的定位和定点打印，将DNA探针打印到玻片4的指定位置。DNA点样针11是根据亲水陶瓷有亲水特性的原理利用陶瓷制作的。DNA点样针快速的循环清洗和干燥，并节省90％以上的清洗缓冲液是该专利技术的另一个重要技术。本专利技术点样针的清洗、干燥装置5、6是利用负压抽吸的原理完成DNA点样针的清洗和干燥。当接通负压装置如真空泵后，干燥孔形成高速气流8。当点样针接近时，由于强烈气流，残余在针尖上的水分被快速吸走，达到干燥的目的。而在清洗时，由于点样针的接近，封闭了清洗孔的空气通路，清洗室9内压力骤降，清洗缓冲液10被高速吸出，喷淋在DNA点样针上。喷淋的时间可以由自编电脑程序控制。为了DNA探针能有效地固定在玻片上，通常在DNA探针合成后进行DNA探针5’末端活性基团的标记，这些活性基团有氨基、巯基等，固定DNA的玻片也需进行活化处理。通常进行硅化处理本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种中密度ＤＮＡ（基因）芯片制作方法：它包括先将各种待检测的ＤＮＡ序列找出，并进行探针的合成，合成后在５’末端进行活性基团的修饰，采用点样机点样，其特征在于所说点样机点样是在一块平板上，顶部安置Ｘ轴的直线驱动装置［１］，在微型步进电机的控制下驱动固定在Ｘ轴上的Ｙ轴［２］作左右来回移动，而在Ｙ轴也在微型步进电机的控制下以相同的分辨率步距驱动连接在Ｙ轴上的ＤＮＡ样本打印装置［３］和打印针［７］作前后来回移动，这样，两个微型步进电机和ＤＮＡ打印头分别在驱动程序的控制下，精确地作三维空间的定位和打印，将ＤＮＡ送至指定的位置，并使点样针［１１］与玻片［４］接触，在每一片玻片上相应位置点样，每次循环点样后点样针经清洗、干燥装置［５］、［６］作清洗、干燥处理。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杨梦甦，缪金明，
申请(专利权)人：杨梦甦，
类型：发明
国别省市：HK[中国|香港]