甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录--聚合酶链反应检测法制造技术

本发明专利技术是一种检测甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录－聚合酶锭反应检测法。该法选用编码甲肝病毒结构蛋白３羧基端的基因区为目标区，设计合成引物，并严格的运用逆转录－聚合酶链反应技术对甲肝活疫苗的滴度进行检测。该技术的检测灵敏度与组织培养半数感染量相仿，但时间可从１个月缩短为一天，具有快速、简便、灵敏、特异的特点，可用于甲肝活疫苗的常规检测及质量控制。该技术还可应用于甲肝病毒的临床诊断，实验室诊断和流行病学调查。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术是一种检测法，特别是用于快速检测甲肝减毒活疫苗滴度的分子生物学检测方法。甲型肝炎是世界性的传染病，它是由甲型肝炎病毒(HAV)引起的，全世界约40亿人受其威胁。为此，全世界许多科学家对此进行了艰苦卓绝的工作，现已研制成功甲肝减毒活疫苗，有效地控制了甲肝的流行。但甲肝减毒活疫苗引起机体产生免疫力主要是活病毒的数量而不是抗原的总量，由于HAV的繁殖特点，空泡病毒(无RNA)含量较高，而常规ELISA法由于主要检测抗原，所得结果并不能体现活病毒的多少，只能作为参考，且灵敏度较差；组织培养半数感染量(TCID50法)，虽能体现活病毒的多少，但耗时较长(约一个月)，操作繁锁，无法适应需要，而逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法，则可克服上述缺点，是一个新方法的研究。本专利技术的目的是研制出一种快速、灵敏、简便、特异的检测。甲肝减毒活疫苗的滴度的分子生物学检测方法。以逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)法替代甲肝活疫苗滴度的常规组织培养半数感染量(TCID50)法，检测效果好，大大缩短了检测时间，是理想的检测甲肝减毒活疫苗滴度的方法。本专利技术选择编码HAV结构蛋白3(VP3)羧基端的基因区为目标区，设计合成引物，并进行严格的RT-PCR反应。获得良好的结果，具体步骤如下1、引物设计参考甲肝病毒核苷酸序列，选择编码HAV VP3羧基端的基因区为目标区，设计合成引物。2、甲肝疫苗的处理甲肝疫苗数支混合，取1ml加入1.5ml离心管中，加入聚乙二醇和氯化钠，3℃-8℃沉淀2小时以上，离心，去除上清，沉淀用溶解液溶解。3、逆转录—聚合酶链反应(RT-PCR)用溶解液稀释已溶解的疫苗病毒至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5……，每个稀释度各做4管，反应条件如下1ul样品，2ul10×PCR缓冲液，4ul25mmol/L氯化镁(MgCl2)，3.2ul二乙基焦碳酸盐处理的水(DEPC-H2O)，4×2ul10umol/L脱氧核苷酸(dNTP)，负链引物2ul，97℃作用5分钟。再加入核糖核酸酶抑制剂(RNasin)0.5ul，混匀后在42℃作用45分钟，99℃ 5分钟。然后，在上述反应管中加入4ulMgc12，8ul10×PCR缓冲液，Tag酶0.5ul，正链引物2ul，补双蒸水至100ul，混匀后覆盖液体石蜡，然后进入PCR循环，94℃ 60秒，52℃ 30秒，72℃ 60秒，共循环30～35周，其中第一循环94℃ 5分钟，最后一个循环72℃反应时间延长为10分钟。4、电泳检测取10ulPCR产物，1.5％琼脂糖电泳检测。5、逆转录—聚合酶链反应阳性的判断甲肝疫苗经RT-PCR反应，琼脂糖电泳后，在约200bP处肉眼可见一电泳带的为阳性。6、RT-PCR值的计算以1ml疫苗的总病毒为1，按以下公式计算。 7、获得甲肝减毒活疫苗滴度的RT-PCR值。上述方法已完成近200批甲肝减毒活设苗(H2)的检测，结果良好。其灵敏度与TCID50法相仿，可用于甲肝减毒活疫苗的滴度检测。RT-PCR法用于活疫苗质量监控其实际意义巨大。第一，RT-PCR法由于快速灵敏，可在1-2天内完成活疫苗的滴度测定，可减少疫苗生产后存库时间，使疫苗可尽快满足免疫接种所需，保证疫苗的质量，加速产品周转，延长了疫苗的有效期，增加了疫苗的产量，从而加强了疫苗的质量管理，造福人类。此外，该方法还可应用于HAV的临床诊断，实验室诊断及流行病学调查。实施例1取甲肝减毒活疫苗(H2)9306，9307，9404，9508，经混合，聚乙二醇沉淀，磷酸缓冲液—十二烷基月桂酸钠(PBS-SLS)溶解，选择HAV VP3羧基端基因区两侧的核苷酸序列为引物。取甲肝疫苗4支混合，取1ml加入1.5ml离心管中，加入聚乙二醇6000和氯化钠，4℃沉淀过夜，第二天12000g离心，去除上清，沉淀用PBS-SLS溶解，用PBS-SLS稀释已溶解的疫苗病毒至10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，每个稀释度各做4管，反应条件为1ul样品，2ul10×PCR缓冲液，4ul 25mmol/L氯化镁(Mgcl2)，3.2ul二乙基焦碳酸盐处理的水(DEPC-H2O)，4×2ul10umol/l脱氧核苷(dNTP)，负链引物2ul，97℃作用5分种。再加入核糖核酸酶抑制剂(RNasin)(40u/ul购自美国BRL公司)0.5ul，M-MLV逆转录酶0.2ul，混匀后在42℃作用45分种，99℃作用5分钟，然后，在上述反应管中加入4ulMgc12，8ul10×PCR缓冲液，Tag酶(5u/ul购自Promega上海公司)0.5ul，正链引物2ul，补双蒸水至100ul。混匀后，覆盖液体石蜡50ul，然后进入PCR循环；94℃ 60秒，52℃ 30秒，72℃ 60秒共循环33周。其中第一循环94℃ 5分钟，最后一个循环72℃反应时间延长为10分种。取10ulPCR产物，1.5％琼脂糖电泳检测，在约200bP处肉眼可见—电泳带的为阳性。以1ml疫苗的总病毒为1，按以下公式计算RT-PCR值。 获得甲肝减毒活疫苗滴度的RT-PCR值。实施例2采甲肝暴发点患病者粪便或血清样品，经分离，提取纯化，浓缩后，进行RT-PCR反应，逆转录反应条件为97℃ 5min，42℃ 45min，99℃ 2min，PCR反应条件为94℃ 1min，52℃ 30秒，72℃ 1min，循环33次，其中第一循环94℃延长为5分钟，最后一个循环72℃延长为10分钟，反应结束后，取10ml产物，2％琼脂糖电脉，在约200bp位有一条肉眼清晰可见的电泳带约为阳性，反之，则为阴性。权利要求1.一种检测甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录一聚合酶链反应检测法，其特征在于包含以下几个步骤①引物设计参考甲型肝炎病毒核苷酸序列，选择编码甲型肝炎病毒结构蛋白3羧基端的基因区为目标区，设计合成引物。②甲肝疫苗的处理甲肝疫苗数支混合，取1ml加入1.5ml离心管中加入聚乙二醇和氯化钠，3℃～8℃沉淀2小时以上，离心，去除上清，沉淀用溶解液溶解。③逆转录—聚合酶链连反应用溶解液10倍稀释已溶解的疫苗病毒至10-1，10-2……，每个稀释度各做4管。反应条件1ul样品，2ul10×聚合酶链缓冲液，4ul氯化镁，3.2ul二乙基焦碳酸盐处理的水，4×2ul10umol/l脱氧核苷，负链引物2ul，97℃作用5分钟，再加入核糖核酸酶抑制剂0.5ul，M-MLV逆转录酶0.2ul，混匀后在42℃作用45分钟，99℃ 5分钟，然后，在上述反应管中加入4ul氯化镁，8ul10×聚合酶链缓冲液，Tag酶0.5ul，正链引物2ul，补双蒸水至100ul。混匀后覆盖液体石蜡50ul，然后进入聚合酶链循环，共循环30周～35周。④电泳检测取10ul聚合酶链反应产物，1.5％琼脂糖电泳检测。⑤逆转录—聚合酶链阳性的判断甲肝疫苗经逆转录—聚合酶链反应，琼脂糖电泳后，在约200bP处肉眼可见—电泳带的为阳性。⑥获得甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录—聚合酶链反应值。以1ml疫苗的总病毒为1，经逆转录—聚合酶链反应值的计算，得甲肝减毒活疫苗滴度值。全文摘要本专利技术是一种检测甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录－聚合酶锭反应检测法。该法选用编码甲肝病毒结构蛋白本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种检测甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录一聚合酶链反应检测法，其特征在于包含以下几个步骤： ①引物设计 参考甲型肝炎病毒核苷酸序列，选择编码甲型肝炎病毒结构蛋白３羧基端的基因区为目标区，设计合成引物。 ②甲肝疫苗的处理 甲肝疫苗数支混合，取１ｍｌ加入１．５ｍｌ离心管中加入聚乙二醇和氯化钠，３℃～８℃沉淀２小时以上，离心，去除上清，沉淀用溶解液溶解。 ③逆转录－聚合酶链连反应 用溶解液１０倍稀释已溶解的疫苗病毒至１０↑［－１］，１０↑［－２］……，每个稀释度各做４管。反应条件：１ｕｌ样品，２ｕｌ１０×聚合酶链缓冲液，４ｕｌ氯化镁，３．２ｕｌ二乙基焦碳酸盐处理的水，４×２ｕｌ１０ｕｍｏｌ／ｌ脱氧核苷，负链引物２ｕｌ，９７℃作用５分钟，再加入核糖核酸酶抑制剂０．５ｕｌ，Ｍ－ＭＬＶ逆转录酶０．２ｕｌ，混匀后在４２℃作用４５分钟，９９℃５分钟，然后，在上述反应管中加入４ｕｌ氯化镁，８ｕｌ１０×聚合酶链缓冲液，Ｔａｇ酶０．５ｕｌ，正链引物２ｕｌ，补双蒸水至１００ｕｌ。混匀后覆盖液体石蜡５０ｕｌ，然后进入聚合酶链循环，共循环３０周～３５周。 ④电泳检测 取１０ｕｌ聚合酶链反应产物，１．５％琼脂糖电泳检测。 ⑤逆转录－聚合酶链阳性的判断 甲肝疫苗经逆转录－聚合酶链反应，琼脂糖电泳后，在约２００ｂｐ处肉眼可见－电泳带的为阳性。 ⑥获得甲肝减毒活疫苗滴度的逆转录－聚合酶链反应值。 以１ｍｌ疫苗的总病毒为１，经逆转录－聚合酶链反应值的计算，得甲肝减毒活疫苗滴度值。...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：陈勇，罗永能，洪艳，杨连华，毛江森，
申请(专利权)人：浙江省医学科学院普康生物技术公司，浙江省医学科学院，
类型：发明
国别省市：86[中国|杭州]