基于乳酸克鲁维酵母产生保护性单价和多价亚单位疫苗的优化的宿主/载体系统技术方案

本发明专利技术涉及高效表达一或多个外源蛋白并且适用作针对病原体产生保护性免疫应答的疫苗的重组乳酸克鲁维酵母。本发明专利技术特别提供了乳酸克鲁维酵母株将外源抗原编码核酸靶向克隆至乳酸克鲁维酵母株的酵母基因组中，其特征在于所述乳酸克鲁维酵母株作为KlLAC4基因座的替代，在KlURA3‑20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5‑1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒，或除KlLAC4基因座之外，还在KlURA3‑20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5‑1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒。本发明专利技术进一步涉及用于产生本发明专利技术所述乳酸克鲁维酵母株的整合表达载体和方法以及其作为疫苗的用途。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】基于乳酸克鲁维酵母产生保护性单价和多价亚单位疫苗的优化的宿主/载体系统专利
本专利技术涉及重组乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis，K.lactis)，其适合于高效表达一种或多种外源蛋白质及适合用作疫苗以产生针对病原体的保护性免疫应答。本专利技术特别提供了乳酸克鲁维酵母菌株用于将外源抗原编码核酸靶向克隆进乳酸克鲁维酵母菌株的酵母基因组中，其特征在于乳酸克鲁维酵母菌株作为KlLAC4基因座的替换或除了KlLAC4基因座之外，在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒。本专利技术还涉及产生本专利技术乳酸克鲁维酵母菌株的整合表达载体和方法以及其作为疫苗的应用。专利技术背景疫苗用于预防疾病(预防性疫苗)或治疗已确定的疾病(免疫治疗性疫苗)。在过去的100年左右，预防接种计划为减少感染病做出了巨大贡献。诸如针对病毒、细菌或寄生物的持续感染或针对致癌性疾病的免疫治疗疫苗仅开发和使用了大约20年。免疫接种的目标是诱导细胞免疫应答(即基本上是T细胞和NK细胞介导的)和/或体液免疫应答(即基本上是B细胞/抗体介导的)以及诱导针对病原体或恶性(致瘤)细胞的抗原成分的免疫记忆。传统疫苗包含减毒(灭活)或杀死形式的完整病原体，包括其遗传物质，即DNA或RNA形式的核酸。为了生产，所述传统疫苗通常需要特殊的安全防范和/或使用可感染的生物体和/或细胞培养物；此外，所述疫苗通常需要复杂且涉及使用冷链的储存和运输。另外，传统疫苗的使用涉及来自生产过程(例如来自测试动物或来自细胞培养物)的物质导致在接种个体出现不良反应或者病原体意外被再激活的危险。诊断中也存在问题：例如，在用完整病原体接种有用动物的情况中，无法将免疫接种的动物与自然感染的动物区分开，这意味着基于检测新感染的早期预警系统无法使用。因此，开发了所谓的“亚单位疫苗”，其仅用病原体的指定成分进行免疫接种。使用其的前提条件是已知在讨论的病原体的“主要抗原”。主要抗原通常是可以被免疫系统识别的病原体的表面成分，例如病毒外壳或病毒衣壳的蛋白质。在没有完整病毒颗粒的情况中，所述主要抗原也可以在宿主中诱导针对病毒的体液和/或细胞免疫应答和免疫记忆。由于在“亚单位免疫接种”中缺少病原体的其它成分，因此可以通过鉴别诊断将免疫接种的个体与自然感染的个体区分(区分感染的动物与免疫接种的动物(DIVA))；因此，还提及了“亚单位标志物疫苗”。许多亚单位疫苗的缺点是生产过程往往很复杂，免疫原性常常不足：虽然病原体本身可以有效地培养(具有上述局限性)，但其主要抗原必须通过基因技术以成本密集的方式及通常效率低下的方法生产且以复杂的方式纯化。因此，由此获得的亚单位疫苗是具有短保存期限的生物材料且必须经常在冷却状态下存储和运输。由于这些原因，有用动物的大多数大规模疫苗仍基于使用完整病原体的传统原理。例如，普遍的家禽疾病传染性法氏囊病(IBD)是由传染性法氏囊病病毒(IBDV)引起的，该病毒是具有来自双RNA病毒科(Birnaviridae)的双链节段RNA基因组的非包膜病毒。大多数针对IBD的疫苗均基于减毒(弱化)或灭活的病毒。但是，这里出现的问题是，尽管高度减毒的非灭活的“活病毒”以及灭活的病毒也可提供针对平均致病性的IBD病毒的保护作用，但对于毒性极强的IBD病毒株(vvIBDV)却并非如此。直到最近，极强力的减毒病毒(中间热毒株)仍针对vvIBDV起保护作用，但是这些疫苗株由于对法氏囊(BursaFabricii，一种淋巴器官)中B细胞的短暂破坏而具有可能发生免疫抑制形式的不良反应(Rautenschleinetal.(2005))。但是，即使是所述中间热疫苗针对最近发现的vvIBDV株也未提供完全保护作用(Negashetal.(2012)；Kasangaetal.(2007))。此外，用高度减毒的活病毒进行免疫接种的问题是亲本抗体阻止病毒复制，因此阻止了免疫反应的诱导。因此，仅可以在孵化后三周使用这些疫苗进行有效的免疫接种(Kumaretal.(2000)；Rautenschleinetal.(2005))。例如，甲型流感病毒是全球最重要的病毒病原体之一(Shortetal.(2015)；Silvaetal.(2012))。流感病毒属于正粘病毒科(Orthomyxoviridae)；其是具有单链节段RNA作为基因组的包膜病毒。与大多数RNA病毒一样，流感病毒也具有很高的突变率。尤其是病毒RNA片段的重配产生了具有新的遗传和生物学性质的病毒后代(Shortetal.(2015))。由于快速的进化，特别是在针对流感病毒的免疫接种中出现的问题是在新出现的病毒变体的情况中，现有疫苗不能“抓住”。因此，长期以来一直在尝试开发具有交叉保护作用及因此也针对不同流感病毒变体具有长期保护的疫苗(Steeletal.(2010)；KrammerandPalese(2013)；KirchenbaumandRoss(2014)；Berthoudetal.(2011))。牛病毒性腹泻病毒(BVDV)是偶蹄目动物的普遍病原体。BVDV是黄病毒科(Flaviviridae)瘟病毒属成员。这些病毒的单链RNA基因组同样处于高突变率。此外，对于怀孕动物，胎儿可能会被感染，然后由于免疫耐受而生出持续感染(PI)的动物。所述PI动物进一步传播病毒且在100％病毒突变的情况中，死于所谓的粘膜病。在这里，也已经进行了很长时间的尝试来开发针对不同BVD病毒变体具有交叉保护和长期保护作用的疫苗(Ridpath(2015))。有效的亚单位疫苗可以解决这些问题。在大多数情况中，亚单位是病原体的蛋白质成分；其可以通过基因技术在各种宿主细胞中产生。除了肠道细菌大肠杆菌(Escherichiacoli)外，已经建立了可以在细胞培养物中繁殖的哺乳动物细胞或昆虫细胞、植物细胞和各种真菌作为异源蛋白表达的宿主系统。微生物系统如细菌和真菌可以特别经济高效地大规模培养。酵母菌属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)和克鲁维酵母属(Kluyveromyces)的酵母细胞已常规使用数十年以表达外源蛋白质。与细菌相比，酵母细胞的优势在于其是真核生物(即其在许多方面都类似于动物细胞)和真核蛋白(即在动物细胞中形成和/或必须具有功能的蛋白质，可以在酵母中以天然或几乎天然的形式成本有效地生产)(Bathurst(1994)；Gellissen&Hollenberg(1997))。酵母最初仅用于产生外源蛋白质；在表达后，从酵母细胞纯化蛋白质并用作亚单位疫苗。直到最近才尝试将酵母本身或酵母的细胞部分作为疫苗施用。因此，“基于酵母的疫苗”是酵母颗粒，其包含病原体(抗原)的免疫学有效成分并且在施用后(例如皮下、肌内或口服/粘膜)，可在宿主生物体中引起针对所述抗原及因此也针对所述抗原起源的病原体的特异性免疫应答。期望的是在接种的生物体中诱导免疫学“记忆”，其在随后的感染(“攻击”)事件中防止相应病原体的繁殖和/或传播和/或降低感染的病理学作用。如上所述本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)菌株，用于将外源抗原编码核酸靶向克隆进乳酸克鲁维酵母菌株的酵母基因组中，其特征在于，所述乳酸克鲁维酵母菌株作为KlLAC4基因座的替代，在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒，或除KlLAC4基因座之外，还在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171227 DE 102017012109.51.一种乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyceslactis)菌株，用于将外源抗原编码核酸靶向克隆进乳酸克鲁维酵母菌株的酵母基因组中，其特征在于，所述乳酸克鲁维酵母菌株作为KlLAC4基因座的替代，在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒，或除KlLAC4基因座之外，还在KlURA3-20基因座(KLLA0E22771g)和/或在KlMET5-1基因座(KLLA0B03938g)具有整合的外源抗原表达盒。


2.权利要求1的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，所述表达盒包含乳酸克鲁维酵母LAC4-12启动子(PLAC4-12)或所述启动子的变体，包括在LAC12和LAC4之间的基因间区域，所述表达盒还包含抗原编码区和AgTEF1终止子。


3.权利要求1或2的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，通过串联表达盒或多重表达盒在所得乳酸克鲁维酵母菌株的KlLAC4基因座或KlURA3-20基因座或KlMET5-1基因座插入外源抗原编码核酸的多个拷贝。


4.权利要求1-3任一项的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，外源抗原IBDVVP2的基因以串联表达盒的形式存在于乳酸克鲁维酵母菌株的基因座KlLAC4。


5.权利要求1-3任一项的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，不同外源抗原编码核酸的一个或多个拷贝通过单个表达盒、串联表达盒或多重表达盒插入在KlLAC4基因座和/或KlURA3-20基因座和/或KlMET5-1基因座。


6.权利要求1-3和5任一项的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，外源抗原甲型流感HA(A/PuertoRico/8/1934(H1N1))和甲型流感M1(A/PuertoRico/8/1934(H1N1))的编码基因插入在乳酸克鲁维酵母菌株的KlLAC4和KlURA3-20基因座并被表达。


7.前述权利要求任一项的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，所述乳酸克鲁维酵母菌株除了基因组KIGAL4基因之外，额外包含KIGAL4基因的第二异位拷贝。


8.权利要求7的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，侧翼是KIGAL4启动子和KIGAL4终止子的KIGAL4基因的异位拷贝被整合进乳酸克鲁维酵母菌株的基因座KLLA0E13795g(Klavt3::KlGAL4-1,SEQIDNo:1)。


9.前述权利要求任一项的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，外源抗原IBDVVP2的基因存在于所述乳酸克鲁维酵母菌株的基因座KlLAC4。


10.前述权利要求任一项的乳酸克鲁维酵母菌株，所述乳酸克鲁维酵母菌株具有LAC4-12启动子的修饰的启动子结构，其在非诱导条件下仅允许少量外源蛋白表达或不允许外源蛋白表达，其特征在于，缺失了在-1065和-1540之间的启动子PLAC4-12的基础控制区(BCR)(LR2缺失；PLAC4-12-LR2’；SEQIDNo:2)。


11.权利要求10的乳酸克鲁维酵母菌株，其特征在于，外源抗原甲型流感HA(A/PuertoRico/8/1934(H1N1))的基因存在于所述乳酸克鲁维酵母菌株的基因座KlLAC4。


12.前述权利要求任一项的乳酸克鲁维酵母菌株，所述乳酸克鲁维酵母菌株具有可以调节外源蛋白表达的LAC4-12启动子的修饰的启动子结构，其特征在于，所述启动子的激活物KlGal4结合位点(“上游激活序列”1、2和4、5)数目改变并且存在1、2、3或4个KlGal4结合位点。


13.前述权利要...

【专利技术属性】
技术研发人员：H·C·赫里曼，M·贝伦斯，M·格鲍尔，K·布罗伊尼希，SE·贝伦斯，
申请(专利权)人：维罗疫苗有限公司，
类型：发明
国别省市：德国;DE