新的RNA-可编程的内切核酸酶系统及其在基因组编辑和其他应用中的用途技术方案

本发明专利技术的各方面除了别的以外涉及用于靶向、编辑或操纵细胞中DNA的新的系统，其包含一种或多种编码来自路邓葡萄球菌的SluCas9核酸酶或其变体和一种或多种指导RNAs（gRNAs）或SluCas9核酸酶或其变体和一种或多种gRNAs的异源载体。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的RNA-可编程的内切核酸酶系统及其在基因组编辑和其他应用中的用途与相关申请的相互参照本申请要求于2017年12月14日提交的欧洲专利申请No.17207294.4的优先权，其内容整体引入本文作为参考，包括任何附图。领域本公开内容总的来说涉及分子生物学领域，包括组合物和方法，其涉及包括RNA-可编程的内切核酸酶、相关的指导RNAs和/或靶序列的新的系统，以及在各种应用中生产和使用其的方法，包括调节转录的方法，以及在细胞中靶向、编辑和/或操纵DNA的方法。背景内切核酸酶如锌指内切核酸酶（ZFNs）、转录激活因子样效应物核酸酶（TALENs）和核糖核酸酶已被作为位点特异性核酸酶用于基因组靶向、基因组编辑、基因沉默、转录调节、促进重组和其他分子生物学技术。CRISPR-Cas系统提供了新的核酸酶和内切核酸酶的来源，包括CRISPR-Cas9。已在过去几年中广泛利用使用CRISPR（成簇的规律间隔的短回文重复序列（ClusteredRegularlylnterspacedShortPalindromicRepeats））-Cas（（CRISPR相关蛋白）的RNA-指导的DNA靶向原理编辑基因组，如WO2013/176722中所述的。以前已经描述了三种类型的CRISPR-Cas系统（类型I、类型II和IIb以及类型III），且最近鉴定了第四种（类型V）。CRISPR-Cas用于基因组编辑的大多数用途以前借助类型II系统。由细菌类型IICRISPR-Cas系统提供的主要优点在于对可编程的DNA干扰的最小限度的要求：内切核酸酶，Cas9，由可定制的双重RNA（dual-RNA）结构指导的。如最初在原始的酿脓链球菌（Streptococcuspyogenes）的类型II系统中所证明的，反式激活CRISPRRNA（tracrRNA）与前体CRISPRRNA（前crRNA（pre-crRNA））的不变重复序列结合，从而形成在有Cas9的情况下RNA酶III对RNA的共成熟和通过Cas9的侵入DNA切割两者都必不可少的双重RNA。如在酿脓链球菌中所证明的，由成熟的激活tracrRNA和靶向crRNA之间形成的双链体指导的Cas9在侵入关联DNA中引入位点特异性双链DNA（dsDNA）断裂。Cas9是多结构域酶，其使用HNH核酸酶结构域切割靶链（定义为与crRNA的间隔区序列互补），并使用RuvC-样结构域切割非靶链，从而使得能够通过选择性基序失活将dsDNA切割性Cas9转化成切口酶。DNA切割特异性由两个参数决定：靶向原间隔区（protospacer）序列的crRNA的可变的、间隔区衍生的序列（原间隔区定义为不与crRNA的间隔区互补的DNA靶上的序列）和紧接在非靶DNA链上原间隔区的3'（下游）定位的短序列，原间隔区相邻基序（ProtospacerAdjacentMotif）（PAM）。研究已证明，RNA-指导的Cas9可用作人细胞、小鼠、斑马鱼、果蝇、蠕虫、植物、酵母和细菌以及各种其他物种中的基因组编辑工具。所述系统是通用的，从而使得能够通过对Cas9进行编程以使用多种指导RNAs同时编辑基因组中的几个位点来进行多重基因组人工改造。将Cas9转化为切口酶被证明促进在诱变活性降低的情况下在哺乳动物基因组中的同源性指导的修复。此外，例如，已经利用Cas9催化失活突变体的DNA结合活性来人工改造RNA-可编程的转录沉默和激活设备或外遗传修饰因子（epigeneticmodifiers）。本专利技术提供了来自路邓葡萄球菌（Staphylococcuslugdunensis）的CRISPR-Cas9家族的新的CRISPR-Cas内切核酸酶（SluCas9）及其变体，其具有与已知的CRISPR-Cas内切核酸酶不同和有利的特征和功能性，并因而提供了以前不存在的用于基因组编辑的进一步的机会。本专利技术进一步提供了供原核、真核和体外环境之用的合适的PAM序列和合适的指导RNAs（gRNAs），例如单一指导-RNAs（sgRNAs）。现有的CRISPR-Cas9系统具有一个或多个以下缺点：a）它们的大小太大，以致于无法携带到确立的治疗上合适的病毒转染系统（如腺伴随病毒（AAVs））的基因组内。b）它们在非宿主环境中的活性通常对于在这些环境中使用来说太低了，例如对于在真核生物且特别在哺乳动物环境中有效使用来说太低了。c）它们的核酸酶作用缺乏保真度，从而导致不想要的脱靶（offtarget）效应，这将例如使它们不适合于基因治疗用途或需要高精度的其他应用。d）它们可能触发免疫应答，这可限制其在哺乳动物体内应用的用途。e）它们要求复杂和/或长的PAMs，这限制了对于DNA靶向区段的靶选择。本文提供的新的SluCas9CRISPR-Cas系统表现出比起现有的CRISPR-Cas系统来有利的特征。在一些实施方案中，SluCas9CRISPR-Cas系统在原核、真核和/或体外环境中表现出更高的活性，和/或Cas内切核酸酶在真核环境（如例如，人宿主细胞）中自核酸的更高表达。概述这个部分提供了本公开内容的总的概述，而不包含其全部范围或所有其特征。在一些实施方案中，本文提供了组合物和方法，其涉及包括RNA-可编程的内切核酸酶、相关的指导RNAs和/或靶序列的新的系统，以及在各种应用中生产和使用其的方法，包括调节转录的方法，以及使用这种核酸和/或多肽靶向、编辑和/或操纵DNA的方法。本公开内容的一些实施方案还涉及包含本文公开的一种或多种系统元件的重组细胞和试剂盒。在一方面，本文提供了一种组合物，其包含（a）根据SEQIDNO：2的SluCas9多肽或其以下变体：（I）在其全长或从SEQIDNO：2的位置789到位置1053上与根据SEQIDNO：2的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％氨基酸同一性的变体；（II）根据（I）的变体，其含有额外的组分，如例如，核定位信号，以获取包含SluCas9多肽的SluCas9CRISPR系统在无细胞反应或在原核细胞中以及在真核细胞环境中（例如，在活的植物或动物中）的活性，例如根据SEQIDNO：3的多核苷酸序列；（III）编码SluCas9以及根据（I）和（II）的变体的相应多核苷酸序列的密码子优化的变体，例如SEQIDNO：3从位置61至位置3225的多核苷酸序列和根据SEQIDNO：44和45的多核苷酸序列；或（IV）根据（I）至（III）中任一项的变体，其进一步包含i.导致具有与不具有一种或多种修饰或突变的相应SluCas9（例如，包含SEQIDNO：2的氨基酸序列的SluCas9）相比显著降低的核酸酶活性或不可检测的核酸酶活性的SluCas9的一种或多种修饰或突变，例如一种或多种氨基酸取代（例如，丙氨酸取代），其中相对于SEQIDNO：2，取代是在位置10（例如，D10A）、位置559（例如，H559A）和/或位置582（例如N582A）；和/或ii.具有核碱基（nucleobase）编本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.组合物，其包含/n（a）根据SEQ ID NO：2的SluCas9多肽或其以下变体：/n（I）在其全长或从SEQ ID NO：2的位置789到位置1053上与根据SEQ ID NO：2的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％氨基酸同一性的变体；/n（II）根据（I）的变体，其含有额外的组分，如例如，核定位信号，以获取包含SluCas9多肽的SluCas9 CRISPR系统在无细胞反应或在原核细胞中以及在真核细胞环境中例如在活的植物或动物中的活性，例如根据SEQ ID NO：3的多核苷酸序列；/n（III）编码SluCas9以及根据（I）和（II）的变体的相应多核苷酸序列的密码子优化的变体，例如SEQ ID NO：3从位置61至位置3225的多核苷酸序列和根据SEQ ID NO：44和45的多核苷酸序列；或/n（IV）根据（I）至（III）中任一项的变体，其进一步包含/ni.导致具有与不具有一种或多种修饰或突变的相应SluCas9（例如，包含SEQ ID NO：2的氨基酸序列的SluCas9）相比显著降低的核酸酶活性或不可检测的核酸酶活性的SluCas9的一种或多种修饰或突变，例如一种或多种氨基酸取代（例如，丙氨酸取代），其中相对于SEQ ID NO：2，取代是在位置10 （例如，D10A）、位置559（例如，H559A）和/或位置582（例如N582A）；和/或/nii.具有核碱基编辑活性或脱氨酶活性的C-或N-末端附着的多肽，例如，经由接头肽序列附着的；和/n（b）一种或多种单一异源指导RNA（sgRNA）或编码所述一种或多种sgRNA的核酸（例如，DNA），每种sgRNA包含：/n（I）包含RNA并且能够与多核苷酸基因座中的靶序列杂交的DNA-靶向区段，/n（II）包含RNA的tracr配对物序列，和/n（III）包含RNA的tracr RNA序列，其中所述tracr配对物序列能够与所述tracr序列杂交，且其中（I）、（II）和（III）以5'至3'的取向排列。/n...

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20171214 EP 17207294.41.组合物，其包含
（a）根据SEQIDNO：2的SluCas9多肽或其以下变体：
（I）在其全长或从SEQIDNO：2的位置789到位置1053上与根据SEQIDNO：2的序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％氨基酸同一性的变体；
（II）根据（I）的变体，其含有额外的组分，如例如，核定位信号，以获取包含SluCas9多肽的SluCas9CRISPR系统在无细胞反应或在原核细胞中以及在真核细胞环境中例如在活的植物或动物中的活性，例如根据SEQIDNO：3的多核苷酸序列；
（III）编码SluCas9以及根据（I）和（II）的变体的相应多核苷酸序列的密码子优化的变体，例如SEQIDNO：3从位置61至位置3225的多核苷酸序列和根据SEQIDNO：44和45的多核苷酸序列；或
（IV）根据（I）至（III）中任一项的变体，其进一步包含
i.导致具有与不具有一种或多种修饰或突变的相应SluCas9（例如，包含SEQIDNO：2的氨基酸序列的SluCas9）相比显著降低的核酸酶活性或不可检测的核酸酶活性的SluCas9的一种或多种修饰或突变，例如一种或多种氨基酸取代（例如，丙氨酸取代），其中相对于SEQIDNO：2，取代是在位置10（例如，D10A）、位置559（例如，H559A）和/或位置582（例如N582A）；和/或
ii.具有核碱基编辑活性或脱氨酶活性的C-或N-末端附着的多肽，例如，经由接头肽序列附着的；和
（b）一种或多种单一异源指导RNA（sgRNA）或编码所述一种或多种sgRNA的核酸（例如，DNA），每种sgRNA包含：
（I）包含RNA并且能够与多核苷酸基因座中的靶序列杂交的DNA-靶向区段，
（II）包含RNA的tracr配对物序列，和
（III）包含RNA的tracrRNA序列，其中所述tracr配对物序列能够与所述tracr序列杂交，且其中（I）、（II）和（III）以5'至3'的取向排列。


2.权利要求1的组合物，其中（a）的SluCas9多肽包含与SEQIDNO：2的从位置789到位置1053连端点在内的氨基酸序列具有至少75％氨基酸同一性的氨基酸的邻接序列（例如，265个氨基酸的邻接序列）。


3.权利要求1的组合物，其中（a）的SluCas9多肽包含与SEQIDNO：2的从位置789到位置1053连端点在内的氨基酸序列具有至少90％氨基酸同一性的氨基酸的邻接序列（例如，265个氨基酸的邻接序列）。


4.权利要求1-3任一项的组合物，其中所述DNA-靶向区段的长度为18个核苷酸至22个核苷酸，并且其中在多核苷酸基因座中且与靶序列互补的原间隔区序列在其3'末端正好与对于（a）的SluCas9多肽合适的PAM序列相邻，或这种PAM序列是DNA-靶向区段的3'部分的一部分。


5.权利要求1-4任一项的组合物，其中在多核苷酸基因座中且与靶序列互补的原间隔区序列在其3'末端正好与PAM序列“NNGG”相邻，或这种PAM...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·科宁，M·施米德特，W·科科，A·古普塔，J·特贝，C·舒伦伯格，C·皮茨勒，M·B·贾马林达，S·贾赫，F·里希特，A·阿鲁穆罕，C·萨尔维希特，
申请(专利权)人：克里斯珀医疗股份公司，拜尔健康护理有限责任公司，
类型：发明
国别省市：瑞士;CH