一种体外检测方法及用于这种方法的试剂盒技术

本发明专利技术涉及癌及癌前期的早期诊断方法，包括在一机体样品中确定细胞周期调节蛋白的过表达。本发明专利技术还涉及可用于所述方法的试剂盒。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及癌及癌前期的早期诊断方法，特别是上呼吸道或肛殖道。自50年代中期以来对大多数不同的癌已提供了预防计划。关于宫颈癌，主要是基于宫颈的细胞涂片的形态学和细胞学检查，即所谓的Pap测试，其基于妇女从20岁起定期进行的妇科学常规检查。通过细胞的形态学，涂片被分成各种强度程度的发育异常细胞变化。根据Pap I-V，这些强度程度分别代表正常、清度发育异常、稍严重发育异常、严重发育异常和浸润性癌。如果Pap测试产生令人震惊的结果，则进行小规模活组织检查并进行组织病理学检查，由此将发育异常的种类和强度确定并划分为宫颈上皮内癌(CINI-III)。尽管有预防计划，但是每年增加400000个新病例的宫颈癌仍是妇女中发生频率为第二位的癌症。这特别是由于Pap测试结果的近30％是假阴性所致。因此，本专利技术的目的是提供一种可以早期和可靠诊断宫颈癌的方法。另外，由此方法应可以区分肿瘤形成前发育异常的良性炎性改变或化生改变。根据本专利技术，这可通过权利要求书中定义的本专利技术主题实现。本专利技术基于申请人的如下观察即细胞周期调节蛋白在许多癌，例如上呼吸道或肛殖道癌、特别是宫颈癌以及这些癌的前期中过表达。细胞周期调节蛋白的例子为细胞周期蛋白。特别提及的是调节细胞周期蛋白的细胞周期蛋白依赖性激酶，更特别提及的是调节细胞周期蛋白依赖性激酶的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白的例子为蛋白质p14，p15，p16，p19，p21和p27。本申请人发现细胞周期调节蛋白的过表达的强度与细胞发育异常程度相关。根据本专利技术，本申请人的观察用作一种癌及癌前期的早期诊断方法，其包括在一机体样品中确定细胞周期蛋白的过表达。术语“癌及癌前期”包括任何种类和任何起源的癌及其前期。例如，它们可以是上呼吸道或肛殖道癌，特别是宫颈癌。宫颈癌中，特别提及的是其前期，例如宫颈上皮内癌(CINI-III)，原位癌(CIS)等。术语“细胞周期调节蛋白”包括任何种类和起源的细胞周期调节蛋白。例如，这些蛋白可以是细胞周期蛋白。特别是，它们可以是调节细胞周期蛋白的细胞周期蛋白依赖性激酶。细胞周期蛋白依赖性激酶的例子是蛋白质cdk4和cdk6。更特别地，它们可以是调节细胞周期蛋白依赖性激酶的细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白。细胞周期蛋白依赖性激酶抑制蛋白的例子是蛋白质p14，p15，p16，p19，p21和p27，优选的是p16。术语“机体样品”包括可以检测细胞周期调节蛋白的任何机体样品，这种机体样品的例子是血、涂片、痰、尿、粪便、液体(liquor)、胆汁、胃肠道分泌物、淋巴、骨髓、器官穿刺物或抽吸物和活组织检查样品。当检查肛殖道癌例如宫颈癌时，特别提及的是涂片和活检样品。术语“确定细胞周期调节蛋白的过表达”包括适于检测细胞周期调节蛋白或其编码mRNA的表达和相应基因的扩增的任何方法。为确定过表达，显然是将待检查的机体样品与来自健康人的相应机体样品相比较，这种样品可作为标准形式存在。细胞周期调节蛋白的(过)表达可在核酸水平和蛋白质水平检测。对于蛋白质水平的检测，可以使用例如针对细胞周期调节蛋白的抗体，这些抗体可用于大多数不同方法中，如Western印迹、ELISA或免疫沉淀。有利的是抗体固定在固相载体如测试条或乳胶颗粒上。通过本专利技术，可以早期诊断癌症，即在其前期诊断。本专利技术的另一主题涉及进行本专利技术方法的试剂盒，这种试剂盒包括(a)检测细胞周期调节蛋白的表达的试剂，例如针对这种蛋白的抗体，或编码这种蛋白或其部分的核酸，(b)常规助剂，如缓冲剂、载体、标记物等，和任选地(c)用于对照反应的制剂，例如一种细胞周期调节蛋白，编码这种蛋白及其部分的核酸，或细胞制备物，例如组织切片或固定在玻片上的细胞。以上陈述相应地适于所述试剂盒的各组分。另外，可存在各个组分的一或几个代表。通过本专利技术，可以早期诊断癌，特别是可以早期诊断癌前期。还可以区分肿瘤形成前发育异常的良性炎性改变或化生改变。另一个特征是本专利技术方法获得的结果不进行主观评价，因而Pap测试或组织学制备的假阴性和假阳性结果可以避免。另外，本专利技术可以快速简便地操作，因而可用于深入筛选措施，特别是在第三世界国家中。因此，本专利技术对现今癌症诊断作出了重要贡献。图2示出在HPV16转化的NIH3T3细胞中cdk6和p19的过表达的检测。co代表对照。本专利技术通过以下实施例解释。实施例1 在子宫颈活检样品中检测p16的过表达(A)从20个子宫颈活检样品产生厚度为3-5微米的石蜡切片，其包括所有程度的发育异常进程，从正常组织(n＝2)经CIN I(n＝4)，II(n＝4)，III(n＝5)病变至浸润性癌(n＝5)。它们在二甲苯中脱石蜡2×10分钟并用乙醇再氢化。抗原于10mM柠檬酸盐缓冲液(pH6.0)中在高压灭菌器中于110℃、10分钟解蔽。之后用在PBS中的0.25％H2O2失活内源性过氧化物酶。用马血清(Vectastain ABC检测试剂盒，VectroLaboratories，Burlingame，美国加利福尼亚州)在室温封闭非特异性结合位点20分钟，随后切片在存在3％胎牛血清时与p16特异性单克隆抗体(Neomarkers，Fremont，美国加利福尼亚州)在室温保温45分钟。为检测p16抗体结合，加入生物素化第二抗体(马抗鼠IgG，Vectastain试剂盒，同上)保温30分钟，之后，用Vectastain试剂盒的试剂根据其指导检测结合的第二抗体，并用Mayer苏木精明矾溶液进行核心复染。结果示出p16的过表达存在于发育异常细胞中，还示出p16过表达强度与细胞发育异常程度相关。(B)另外，从78个子宫颈活检样品制备石蜡切片，活检样品涉及正常组织(n＝12)，CIN I(n＝15)，II(n＝14)，III(n＝18)阶段的发育异常病变及浸润性癌(n＝19)。石蜡切片如上(A)所述处理。获得表1所示数据。表1p16表达强度组织学n＝ - + +++++正常 129 3CIN I 1510 3 2CIN II141 4 9CIN III 189 9CxCa 191 18总计 7820 10 2127由表1数据可看出，p16在发育异常和浸润性癌的细胞中过表达，过表达随着发育异常程度向浸润性癌发展而增加。(C)另外，来自180个子宫颈癌生物活检样品的石蜡切片如上述(A)方式处理。另外，测定与上述p16特异性单克隆抗体反应的细胞百分数。在HPV阳性和HPV阴性发育异常和浸润性癌之间也进行区分，获得表2所示数据。表2过表达p16的细胞百分数n 平均百分数±标准偏差CIN I 3254.9±24.0HPV阴性 1754.0±27.2HPV阳性 1555.9±21.0CIN II3270.8±18.9HPV阴性 1476.0±15.8HPV阳性 1866.8±20.5CIN III 6092.4±10.2HPV阴性 9 94.4±7.5HPV阳性 5192.1±10.7浸润性癌 5897.8±5.2HPV阴性 5 96.4±8.1HPV阳性 5397.9±4.9表2数据显示p16在发育异常和浸润性癌的HPV阳性和HPV阴性细胞中均过表达，这一结果经正常组织的本文档来自技高网...

【技术保护点】
癌及癌前期的早期诊断方法，包括在一机体样品中确定细胞周期调节蛋白的过表达。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：马格努斯冯克内贝尔德贝瑞茨，迪米特里施皮科夫斯凯，
申请(专利权)人：马格努斯冯克内贝尔德贝瑞茨，德国公共权利基金会癌症研究中心，
类型：发明
国别省市：DE[德国]