抗丙型肝炎病毒抗体及其用途制造技术

叙述了一种新颖的抗体，该抗体特异性识别ＨＣＶ糖蛋白Ｅ２的构象依赖性表位，并能中和Ｅ２蛋白与易感性细胞的结合。另外，提供了上述抗体识别的抗原和表位，以及编码所述抗体的多核苷酸。还提供了载体，其包含所述多核苷酸和被其转化的宿主细胞，以及其在所述抗体产生中的用途。另外，提供了药物和诊断组合物，其包含任何上述的抗体、抗原、表位、多核苷酸、载体或细胞。还叙述了上述抗体、抗原、多核苷酸和载体在继承性免疫治疗，优选在治疗或预防肝移植中ＨＣＶ感染的用途。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及能特异性结合丙型肝炎病毒(HCV)糖蛋白E2的构象依赖性表位的人抗体，及其各种用途。在本说明书中引用了数篇文献。各篇文献在此引入以供参考(包括制造厂商说明书、指南等)；然而，并不认为所引用的任何文献确实是本专利技术的现有技术。
技术介绍
丙型肝炎病毒(HCV)是非甲非乙型肝炎的主要病原体。已估计献血者人群中的HCV感染流行率在0.4到2％范围内(Choo等，1989)。在70％以上的病人中，急性HCV感染引起慢性肝炎的产生，它能向肝硬化和肝细胞癌演化(Saito等，1990)。HCV是一种具有包膜的、正链RNA病毒，归类于黄病毒科(Francki等，1991,Miller等，1990)。它含有约9,500nts的基因组，编码3010到3033个氨基酸的一种多蛋白。宿主和病毒蛋白酶对该多蛋白的加工导致产生结构蛋白和非结构(NS)蛋白(Rice等，1996)。结构蛋白包括核衣壳和两个推定的病毒粒子包膜糖蛋白E1和E2(Miyamura等，1993)。非结构蛋白包括NS2到NS5抗原。在一些人中，急性感染成功的缓解，表明HCV可被宿主免疫系统控制。宿主克服HCV感染的机制仍然未知。以前的报道强烈提示，人和黑猩猩能产生病毒中和性抗体(Choo等，1994,Farci等，1994,1996,Shimizu等，1994)。在用重组E1和E2蛋白免疫接种后，已成功实现了体内的保护黑猩猩防止被同源HCV分离物初次感染(Choo等，1994)。在该研究中，只有那些显示抗E2抗体高滴度的黑猩猩受到了保护。虽然未鉴定出未识别中和抗原结构域，但推测免疫原的构象对中和性抗体的诱导是关键的。由于到目前为止，尚无培养病毒和开发中和试验的有效体外复制系统，因此正在积极寻找评估抗-E1/E2抗体的生物学功能的其它试验。已在初步的研究中描述了对病毒附着于推测的易感细胞上的预防方法(Shimizu等，1994,Zibert等，1995)。更近的，已开发了一种“体外”中和结合(NOB)的试验，其利用了高度纯化的E2蛋白与易感性靶细胞的特异性结合(Rosa等，1996)。该试验使得能定量评价能中和E2与这些细胞的结合的NOB抗体。用该系统，Rosa等已显示，只有用E1和E2蛋白免疫，产生抗-NOB高滴度的黑猩猩才受到保护，对抗攻击性感染(Rosa等，1996)，提示NOB活性可能是“体内”病毒感染被中和的一种指标。在HIV感染中，一种类似的模式最近已显示，抗体与包膜糖蛋白寡聚物结合的亲和力是病毒中和的良好预告(Fouts等，1997)。另一种评估抗-E1和/或抗-E2抗体的生物学活性的方法包括，测试这些抗体识别据信存在于病毒颗粒表面的天然结构的能力。体外研究已显示，E1和E2相互反应，形成非共价连接的复合物(Deleersnyder等，1997,Ralston等，1993)。已提出这些复合物代表HCV病毒颗粒的功能性亚基(Deleersnyder等，1997,Dubuisson等，1994,Dubuisson和Rice,1996,Ralston等，1993)。对病毒感染中B细胞所有组成成分的探测，对于理解与这些感染有关的病理是关键的。人单克隆抗体提供了另一种方法。对于HCV，仅报道了对有限数目的病毒抗原的这类抗体的分离和特性分析。这些包括核衣壳、NS3和NS4蛋白质(Akatsuka等，1993,Cerino等，1991,1993,Chan等，1996,Mondelli等，1994)和最近的是糖蛋白E2(Chan等，1996)。对于后一种情况，作者使用了噬菌体展示技术，与合成肽的使用结合，来筛选抗-E2免疫反应性，并能获得特异性IgG单链Fvs，其识别E2序列。虽然鉴定到了一种特异性线性表位序列，但未描述过该抗-E2抗体的生物学活性，并且该抗体在控制感染进程中的推定作用仍然未限定。最近，WO97/40176描述了从一组合文库中获得的免疫球蛋白分子，其能特异性与HCV E2抗原结合。虽然显示这些免疫球蛋白的Fab片段在中和结合试验中具有结合活性，但发现重组表达的Fab克隆和对应的完整IgG分子在中和HCV E2多肽的结合中是无效的。专利技术简述本专利技术涉及新颖抗体，其包括人抗体可变区的至少一个互补决定区(CDR)，能特异性识别HCV糖蛋白E2的构象依赖性表位。另外，本专利技术涉及被所述抗体识别的抗原。此外，本专利技术涉及编码上述抗体或抗原的多核苷酸、含有所述多核苷酸的载体，以及含有上述多核苷酸或载体的细胞。本专利技术的另一个方面是一种制备能识别HCV糖蛋白E2构象依赖性表位，并能中和E2蛋白与易感性细胞结合的抗体的方法。本专利技术还涉及含有上述抗体、抗原、多核苷酸、载体或细胞的药物和诊断组合物，以及上述化合物在各种治疗和诊断应用中的用途。专利技术详述因此，本专利技术的技术问题是提供治疗和预防人HCV感染的工具和方法。该技术问题的解决是通过提供权利要求中确定特征的实施例而实现，即提供以下抗体，其1)能识别构象依赖性决定簇，2)能识别衍生自不同HCV基因型的抗原，和3)能沉淀据信存在于病毒颗粒表面上的非共价结合的E1E2复合物；和4)能中和E2蛋白与易感性细胞的结合，这提示该抗体体内中和的能力。这些抗体对发展战胜高度易变因子(如HCV)感染的治疗性或预防性策略特别有用。因此，本专利技术涉及一种抗体，其包含至少一个(优选两个，更优选三个、四个或五个，和最优选六个)人抗体VH和/或VL区的互补决定区(CDR)，所述VH和/或VL区包含图5(VL)(SEQ ID NO:1)和图6(VH)(SEQ ID NO:3)描述的DNA序列编码的氨基酸序列，其特异性识别丙型肝炎病毒糖蛋白E2的构象依赖性表位，并能沉淀共价或非共价结合的E2/E1复合物。另外，和/或本专利技术的抗体还包含人免疫球蛋白链VL区的至少1,2或3个CDR，包含SEQ ID:6的氨基酸序列，并由SEQ ID NO:5(代表编码SEQ ID NO:1(图5)的VL等位变体)描述的DNA序列编码。本领域技术人员知道，抗体的各可变区(重链VH和轻链VL)包含三个高变区，有时称为互补决定区或“CDR”，侧接4个相对保守的构架区，或“FR”。可测定本专利技术抗体可变区中包含的CDR，如根据Kabat，免疫学感兴趣的蛋白质序列(U.S.Department of Health and Human Services,3rdedition,1983,4thedition,1987,5thedition 1990)。本领域技术人员可轻易理解，可使用具有上述可变区的抗体可变区，来构建其它具有所需特异性和生物功能的多肽或抗体。因此，本专利技术还包括含有至少一个上述可变区的CDR，并有利的，具有与本文所附实施例中描述的抗体结合性能基本相同或相似的多肽和抗体。本领域技术人员将易于理解，使用上述可变区或CDR，可根据本领域已知方法，如EP-A1 0 451 216和EP-A1 0549 581中所述的方法构建上述抗体。术语“丙型肝炎病毒糖蛋白E2的构象依赖性表位”指被本专利技术的抗体识别的表位的非线性性质。这意味着该表位的抗原决定簇是由HCV糖蛋白E2的三维结构提供的，而不是由其氨基酸序列提供的。术语“能沉淀共价或非共价结合的E2/E1复合物”本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗体，其特征在于，该抗体包含人抗体的重链可变区和／或轻链可变区的至少一个互补决定区，所述重链和／或轻链可变区包含由图５的轻链可变区（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１），以及图６的重链可变区（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）描述的ＤＮＡ序列编码的氨基酸序列，所述氨基酸序列特异性识别丙型肝炎病毒糖蛋白Ｅ２的构象依赖性表位，而且能沉淀共价或非共价结合的Ｅ２／Ｅ１复合物。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C赖特尔，F哈伯泽策尔，A富尔尼勒，C特列波，C德格朗热，G安绍斯普，
申请(专利权)人：展马博联合股份有限公司，国家健康及医学研究院INSERM，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]