马疫锥虫抗原片检测试剂及其制备与应用制造技术

抗双链脱氧核糖核酸（ｄｓ－ＤＮＡ）抗体是系统性红斑狼疮（ＳＬＥ）高度特异性抗体，并与ＳＬＥ疾病活动性密切相关。本发明专利技术研制了检测抗ｄｓ－ＤＮＡ抗体检测试剂马疫锥虫（ＴＥ）抗原片，以及利用该试剂建立了间接免疫荧光法（ＴＥ－ⅡＦ）检测抗ｄｓ－ＤＮＡ抗体的方法，该方法特异性强，重复性好，结果稳定可靠。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及免疫诊断领域，涉及系统性红斑狼疮(SLE)的临床诊断，更具体地说，涉及马疫锥虫抗原片，及其制备以及应用该检测试剂临床检测SLE的高度特异性抗体抗双链脱氧核糖核酸(ds-DNA)抗体的存在。抗双链脱氧核糖核酸(ds-DNA)抗体是SLE高度特异抗体，在其它情况下很少能检测到，并与SLE疾病活动性密切相关，被公认为诊断SLE的指标之一。抗ds-DNA抗体不仅对于SLE的诊断和鉴别诊断有重要意义，而且对于监视治疗和病情追踪以及判定预后等亦有重要意义。间接免疫荧光法(IIF)为目前临床常规检测抗ds-DNA抗体最常用的方法。1964年Beck等证明锥虫类(单细胞)的核和动基体为纯ds-DNA，不含组蛋白等其它成份。1975年Aarden等报告用短膜虫(Crithidia Lucilia,CL)培养片，1978年Konice等报告采用感染马疫锥虫(Trypaonsoma Epuiperdum,TE)的大鼠血涂片作为抗原底物，采用IIF法测定抗ds-DNA抗体。抗DNA抗体可大体分为与天然(双链)DNA反应的抗体和与变性(单链)DNA反应的抗体两种。抗双链DNA(ds-DNA)抗体主要见于SLE，阳性率在40％左右，以上为活动期患者，而在非SLE患者和正常人则多为阴性。有时其它结缔组织病患者抗ds-DNA也可为阳性，如干燥综合征(SS)、药物性狼疮(DIL)、混合性结缔组织病(MCTD)等，但阳性率低，一般＜1O％，抗体滴度也较低，且此类病人一般认为是SLE重叠综合征。由于抗ds-DNA抗体对SLE具有高度特异性，因此是目前公认的SLE血清特异性抗体，被列为SLE诊断标准之一。抗ds-DNA抗体在SLE的发病机理中起重要作用SLE并发的肾炎(狼疮性肾炎)是由抗DNA抗体介导的一种免疫复合物病。抗ds-DNA抗体亦可形成多种冷沉淀而致血管炎。该抗体的存在易引起SLE肾炎和典型的蝶形红斑。抗ds-DNA抗体与SLE疾病活动性关系密切，其抗体滴度多与SLE疾病的活动性而升降，活动期增高，缓解期降低甚至转阴。因此，抗ds-DNA抗体对SLE疾病活动期的判断和药物疗效观察很有帮助。抗单链DNA(SS-DNA)抗体双链DNA变性时，双链断开即成单链DNA(SS-DNA)。抗SS-DNA可存在于多种自身免疫性疾病中，包括SLE、DIL、MCTD、SS、PSS(硬皮病)、PM/DM(皮肌炎或多发性肌炎)；也可存在于一些非自身免疫性疾病，如慢性活动性肝炎、细菌和病毒感染。因此，抗SS-DNA抗体对疾病诊断缺乏特异性，在临床上无实用价值。抗ds-DNA抗体的检测方法很多，目前临床常规检测广泛应用的方法有间接免疫荧光法(IIF)、放射免疫分析法(RIA)、酶联免疫吸附试验(ELISA)等。IIF可分为马疫锥虫法(TE-IIF)和短膜虫法(CL-IIF)两种。是目前国内外临床常规检测抗ds-DNA抗体最常用的方法。IIF法具有特异性强、敏感性高、结果可靠、重复性好等优点；此外，该法实验要求的条件低、操做简便、价格便宜、易于推广。有关资料显示IIF法和Farr法比较，两者符合率达90％，IIF法敏感性略逊于Farr法，但特异性高，无假阳性反应；TE-IIF法和CL-IIF法两者符合率为88.70％；TE-IIF法在检测抗ds-DNA抗体同时，可利用抗原基质片中鼠白细胞检测ANA，发现测得结果与常规的鼠肝冰冻切片法的结果有良好的可比性(r=0.9265,p＜0.01)两者核型和滴度基本相符。IIF法存在的问题是抗原基质片制备困难。马疫锥虫法需在小鼠传代。使用不便；短膜虫法需培养及虫和传代保存，长期长传代，操作不当，易于污染。另有文献报告CL动基体含组蛋白，可与待测血清中抗组蛋白抗体交叉反应而致假阳性。RIA(Farr法)Farr法测定的重复性好，可定量，敏感性较IIF法略高，但特异性差，需仪器设备，要求的实验室条件较高，并存在同位素污染及假阳性问题。Farr法则定抗ds-DNA抗体，在7％的正常人中呈假阳性反应，并在非SLE的结缔组织病中也呈低滴度的阳性反应，这可能与国内生产的检测药盒中的抗原ds-DNA不够纯有关。文献报告Ids-DNA中含ss-DNA 1％引起的假阳性就达6％。此外标记ds-DNA有时与非抗体蛋白结合，亦可引起假阳性结果。ELLSA不需特殊设备(同位素测定仪，荧光显微镜等)，但操作繁锁，较IIF未见有更多的优点。ELISA法中存在的主要问题是，同Farr法一样，如人工纯化的ds-DNA抗原不纯，易引起假阳性反应；此外DNA抗原不易吸附于固相载体上，即ds-DNA抗原包被困难。采取预包被措施易引入产生非特异反应的物质或造成ds-DNA变性、解链。以上结果都可致假阳性结果，影响该法特异性。附表IIF法和Farr法检测抗ds-DNA抗体比较(北京协和医院资料)IE-IIF法 CL-IIF法 Farr法SLE 51.2％ 46.9％62.0％SLE活动期 100％93.6％67.7％SLE非活动期 9.5％3.0％ 29.1％结缔组织病(非SLE) 3.0％2.7％ 20.2％非结缔组织病01.8％12.9％正常人 007.0％本专利技术的目的之一是研制检测抗ds-DNA抗体检测试剂马疫锥虫抗原片。本专利技术的另一目的是提供了利用马疫锥虫抗原(TE)体检测抗ds-DNA，为SLE疾病的诊断提供重要指标。本专利技术是如下所述实现的马疫锥虫抗原片制备1、马疫锥虫繁殖将马疫锥虫菌株从液氮中取出，溶化后将其接种于小鼠腹部皮下，感染2-4日，从小白鼠尾部取血置玻片上，显微镜下观察，高倍镜下每视野达30-40条马疫锥虫时即可制片。2、马疫锥虫抗原片制备从感染的小白鼠眼眶部取血。加入添加适量抗凝剂的玻璃试管中，用毛细玻璃管取血，在玻片上涂成直径0.5cm×0.5cm大小圆点，每张片涂十孔，自然晾干，加入干燥剂置锡铂纸包装袋中，用热合器封袋，置-20℃冰箱中保存待用。3、马疫锥虫抗原片鉴定A、DNA抑制试验将已知强阳性反应的病人血清与双链DNA(小牛胸腺DNA、按0.1-0.3mg/ml不同浓度配制)相互作用30-45分钟，然后用该血清作用底物，继用羊或兔抗人IgG荧光标记抗体染色镜检，同时用该病人的阳性血清对照。B、RNA抑制试验将已知强阳性血清与RNA(1mg/mL)相互作用30-45分钟，然后用该血清作用底物，继用羊或兔抗人IgG荧光标记抗体染色镜检，同时做阳性对照。C、DNA酶消化试验将DNA酶(0.1mG/ml)与抗原底物分别作用1、2、4、6小时，然后洗去DNA酶，再加已知的强阳性血清，继用羊或兔抗人IgG荧光标记抗体染色镜检，同时做阳性对照。D、RNA酶消化试验将RNA酶(1mg/ml,0.5mg/ml不同浓度)与底物分别作用1、2、4、6小时，然后洗去RNA酶，再加已知的强阳性血清，继用羊或兔抗人IgG荧光标记抗体染色镜检，同时做阳性对照。E、对照试验用DNA阳性血清和DNA阴性血清分别加在已制备好了的抗原片上，反应30分钟后，加羊或兔抗人IgG荧光标记抗体再反应30分钟后，荧光显微镜下观察结果，阳性血清下的马疫锥虫动基体和核均有特异性荧光染色，阴性血清则无特异性荧光。二、TE抗原片检测ds-本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种抗ｄｓ－ＤＮＡ检测试剂马疫锥虫抗原片其特征在于由下列步骤制备的：Ａ．马疫锥虫的繁殖；Ｂ．制备马疫锥虫抗原片。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：王慧珍，李永哲，崔京涛，
申请(专利权)人：王慧珍，李永哲，崔京涛，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]