一种荧光标记效率检测的方法技术

一种对基因芯片探针标记效率的检测方法，通过检测探针的荧光信号值（Ｆ），确定含有荧光基团的单核苷酸量（ｓ），并以此计算出该种核苷酸的总量（ｎ），最终可获得探针ＤＮＡ的量（ｗ）。以总的探针ＤＮＡ的质量（ｗ）、或以总的探针ＤＮＡ的质量（ｗ）除以模板ｍＲＮＡ或ＤＮＡ的质量（ｒ）的比值ｅ来表示荧光标记效率，可表示为：ｗ＝４×３２４．５×ｎ＝１２９８×（ｍｋ＋１）×ｓ；ｅ＝（ｗ／ｒ）×１００％＝（１２９８×（ｍｋ＋１）×ｓ／ｒ）×１００％。本发明专利技术为指导基因芯片荧光标记方法的改进提供参考的数据，并可用作监控芯片杂交体系，以提高荧光标记的成功率。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术属于基因
，涉及基因芯片技术，尤其涉及一种荧光标记效率的检测方法。基因芯片是九十年代发展起来的一项前沿生物技术。随着生物技术的迅猛发展，20世纪人类最宏伟的计划之一—人类基因组计划预计将提前至2003年完成，届时人类将完成25种染色体(22种常染色体，2种性染色体和1种线粒体染色体)共计30亿对碱基的序列测定，以及小鼠、果蝇、线虫等模式生物的全基因组序列的测定。人类基因组计划将由此进入后基因组时代，研究的重点将由发现基因转向发现基因的功能。人们将逐步阐明从基因到蛋白再到生命现象这一过程的奥秘。如何大规模研究人类约10万条基因的功能，特别是基因相互作用和调控关系，迫切需要一种新的方法能以大规模、高通量的方式进行成千上万个基因在各种生理状态下表达状况的研究。传统的Northern blot杂交或点杂交方法，以及以电泳为基础的基因表达、序列测定、突变和多态性分析等研究方法显然不能适应上述的要求。基因芯片技术由此应运而生。基因芯片技术由此应运而生。将大量的靶基因片段有序地、高密度地(点与点之间的距离一般小于500μm)排列在玻璃、硅等载体上，称之为基因芯片，也叫基因微矩阵(Microarray)。基因芯片可以用荧光检测和计算机软件进行数据的比较和分析，以达到快速、高效、高通量地分析生物信息的目的。基因芯片的概念可追溯到southern blot杂交技术，即DNA-DNA之间通过碱基配对机制形成互补链。随后又发展出northern blot杂交和点杂交技术。.这三种技术都是将核酸样品固定在滤膜上，样品容易扩散，因此在单位面积上点样的密度受到限制，无法进行大规模、高通量的DNA杂交。同时，由于滤膜面积较大而需较多探针量，检测灵敏度较低。为了提高点样密度和检测灵敏度，降低探针用量，以玻璃、硅等材料为载体的基因芯片技术逐步得到了发展。美国affymetrix公司于二十世纪八十年代末至90年代初，率先开展了这方面的研究(Fodor,S.P.A.et al.(1991)Science 251,767-773.)。1992年，该公司运用半导体照相平板技术，在1cm2左右的玻片上原位合成寡聚核苷酸片段，诞生了世界上第一块基因芯片(Southern,E.,Maskos,U.&Elder,R.(1992)Genomics13,1008-1017.)。同时，探针的荧光标记，激光共聚焦扫描(U.S Patent 5981965)和计算机分析(U.S Patent 5974164)等技术也随之发展。1995年，第一块以玻璃为载体的基因芯片(微矩阵)在美国Stanford大学诞生(Schena,M.等(1995)Science.270.(20):467-480.)，这标志着基因芯片技术步入了广泛研究和应用的时期。原位合成寡聚核苷酸芯片具有密集程度高，可合成任意序列的寡聚核苷酸等优点，适用于DNA序列测定、SNP分析等。但其缺点是合成寡聚核苷酸长度有限，因而基因特异性差，而且随长度的增加合成错误率随之增高，作为基因表达谱研究远不如cDNA芯片。cDNA芯片是将微量cDNA片段在玻璃等载体上按矩阵密集排列并固化，也叫微矩阵(Microarray)(DeRisi,J.等(1997)Science 278,680-686.)。基因点样密度虽不及原位合成寡聚核苷酸芯片高，但比用传统载体，如混合纤维素滤膜或尼龙膜的点样密度要高得多，可达到每张载玻片4万个基因。而cDNA芯片最大的优点是靶基因检测特异性非常好，用作表达谱研究结果可靠。目前许多国家实验室和大制药公司都用此类芯片(Baldwin,D等(1999)Curr Opin Plant Biol 2(2):96-103.)。有鉴于基因芯片具有高通量、高信息量、快速、样品用量少、造价低、用途广泛等优点，目前世界上许多国家和地区都已着手进行基因芯片的研制和开发工作。美国政府于1998年正式启动基因芯片计划，NIH、能源部、商业部、司法部、国防部、中央情报局等均参与了此项目。同时斯坦福大学、麻省理工学院及部分国立实验室如Argonne,Oakridge也参与了该项目的研究和开发。英国剑桥大学、欧亚公司也正在从事该领域的研究世界大型制药公司尤其对基因芯片技术用于基因多态性、疾病相关性、基因药物开发和合成或天然药物筛选等领域感兴趣，都已建立了或正在建立自己的芯片设备和技术。目前的基因微矩阵芯片技术包含以下几个关键步骤及流程PCR制备靶基因，点样及固定，探针制备，杂交，检测与分析。基因芯片技术中，探针标记是指通过PCR或逆转录等方法，掺入经过荧光基团修饰的碱基(如dCTP、dUTP)，形成带有荧光标记的DNA探针。探针的标记效率是表达谱芯片技术中较为关键的因素。基因芯片中常用标记方法有反转录法和PCR法，也可以用随机引物法或缺口转移(NickTranslation)法。以反转录法为例，表达谱芯片通常以来源不足的少量mRNA为模板，通过反转录得到带有荧光标记的cDNA探针，其标记的效率的高低对杂交的结果影响很大。如果效率较低，则不得不使用较高的扫描强度扫描杂交结果，这时背景等干扰因素就会相应增加。所以需要有检测荧光标记效率的方法，监控反转录后产物的荧光强度，为提高反转录标记的效率提供可靠的数据。目前，有关基因芯片技术中缺乏有效的荧光探针标记效率检测方法，仅有的一篇报道是将适量标记后的探针进行常规琼脂糖凝胶电泳，然后将凝胶用特殊的荧光扫描仪扫描，可半定量测得探针的荧光强度。由于常规琼脂糖凝胶电泳将引入难以克服的误差如电泳中荧光带的扩散或脱尾问题等，这种方法对探针的检测不够可靠。而且该方法除了使用芯片荧光扫描仪，还需用价格昂贵的荧光扫描仪，故而这种方法的实用性不高。我们专利技术的标记效果检测的方法可靠易行，不需要特殊仪器，相对其他的检测方法有较大的优越性。本专利技术的目的在于寻找一种可靠的探针标记效率的检测方法，为指导标记方法的改进提供参考的数据，并监控芯片杂交体系，提高成功率。本专利技术的构思是这样的总的思路是通过检测探针的荧光信号值(F)，确定含有荧光基团的单核苷酸量(s)，并以此计算出该种核苷酸的总量(n)，最终可获得探针DNA的量(w)。具体如下1．探针的荧光值F与其含有荧光基团量成正比，已知探针的荧光值根据标准曲线法或掺入率法推算，即可推出其含有荧光基团的单核苷酸量s(摩尔单位)。2．通常DNA分子中，不含荧光基团的某单核苷酸与荧光基团的该种单核苷酸的比例为m×k,k为不含荧光基团的某种单核苷酸与含荧光基团的该种单核苷酸掺入DNA中的速度之比，m为反应体系中不含荧光基团的单核苷酸与含荧光基团的单核苷酸两种底物浓度之比。因而标记的核酸产物中该种核苷酸的总量n=(mk+1)×s(单位，摩尔单位)。其中k与反应过程中使用的酶的种类和荧光物质的种类有关。3．总DNA中的四种单核苷酸含量基本相同，即可得探针DNA的量w=4×324.5×n=1298×(mk+1)×s，(公式1)。单位为质量单位(324.5为各碱基的近似分子量)。4．用总的探针的质量(w)除以模板mRNA或DNA的质量(r)，比值即标记效率e，e=(w/r)×100％=(1298×(mk+1)×s/r)×100本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种荧光标记效率检测方法，其特征在于，通过检测探针的荧光信号值（Ｆ），确定含有荧光基团的单核苷酸量（ｓ），并以此计算出该种核苷酸的总量（ｎ），最终可获得探针ＤＮＡ的量（ｗ）。以总的探针ＤＮＡ的质量（ｗ）、或以总的探针ＤＮＡ的质量（ｗ）除以模板ｍＲＮＡ或ＤＮＡ的质量（ｒ）的比值ｅ来表示荧光标记效率，可表示为：ｗ＝４×３２４．５×ｎ＝１２９８×（ｍｋ＋１）×ｓ及通过测得Ｆ值或ｓ值就可知荧光标记效率；ｅ＝（ｗ／ｒ）×１００％＝（１２９８×（ｍｋ＋１）×ｓ／ｒ）×１００％。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：毛裕民，谢毅，李瑶，
申请(专利权)人：上海博道基因开发有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]