钴胺素的分析方法和试剂盒技术

本发明专利技术提供一种分析方法，用于测定身体样品中结合运钴胺素蛋白Ⅱ（ＴＣ Ⅱ）的钴胺素，包括使无细胞体液样品与固定的或可固定的ＴＣ Ⅱ特异性结合配体或结合钴胺素的ＴＣ Ⅱ（ｈｏｌｏ ＴＣ Ⅱ）相接触，将配体结合组分与配体未结合组分相分开，并测定其中ｈｏｌｏ－ＴＣ Ⅱ或ＴＣ－Ⅱ结合的钴胺素含量。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及测定体液中钴胺素或维生素B12的分析方法，具体地说是分析钴胺素代谢活性库的分析方法。钴胺素或维生素B12是一种水溶性维生素，是食物中维生素B复合物的一部分。其核心分子由环绕基础钴原子的四个吡咯(pyrole)单元的咕啉环构成。钴胺素是唯一一种动物或植物不能合成的微生物，必须在肠道中从食物吸收。其可存储在肝中。它由微生物尤其是厌氧细菌和酵母菌合成。钴胺素在体内有辅酶的功能，钴胺素酶催化三种类型的反应(ⅰ)分子内的重排，例如从L一甲基丙二酸单酰辅酶A形成琥珀酰辅酶A；(ⅱ)甲基化，例如通过甲基化高半胱氨酸形成甲硫氨酸和(ⅲ)在一些微生物中将核糖核苷酸还原成脱氧核糖核苷酸。在哺乳动物中，已知只有两种酶促反应，就是上述(ⅰ)和(ⅱ)中提到的，需要钴胺素作为辅酶。在消化过程中，一种称为结合咕啉的唾液蛋白(在本领域中也称为R-结合剂或转运钴胺素蛋白Ⅰ和Ⅱ)，下文称为HC，在上消化道结合钴胺素形成可经过胃的复合物。在回肠中胰酶消化钴胺素-结合咕啉(holo-HC)复合物，释放出的钴胺素随后与称为内因子的蛋白(由胃粘膜分泌)结合，形成另一复合物。在回肠末端壁中钴胺素-内因子复合物与特异性受体结合，其后被一释放因子分离，钴胺素被主动传送通过回肠膜，进入血流。在身体中钴胺素不以显著量的游离形式循环。约99％左右的钴胺素结合于一种转运钴胺素蛋白(TC-Ⅲ)或白蛋白。据信将钴胺素送递给靶组织的蛋白是运钴胺素蛋白Ⅱ(TCⅡ)，一种关键的痕量蛋白，没有它钴胺素就不能穿透细胞膜。除了这种重要代谢功能外，血流中只有6-25％的钴胺素结合于TCⅡ，大部分钴胺素是由HC运输的。TCⅡ是一种45kDa的单链多肽，主要见于血清、精液和脑脊髓流。结合于TCⅡ或holo-TCⅡ的钴胺素附着于细胞膜上的特异性受体，而且一旦结合holo-TCⅡ复合物就由胞饮作用进入细胞。TCⅡ由肝、脉管内皮、肠细胞、巨噬细胞和成纤维细胞合成，主要以apo-TCⅡ(即不结合钴胺素)循环。其半衰期很短，约90分钟。总血浆钴胺素中至多1/4与TCⅡ结合。其余的与上述其它运钴胺素蛋白或白蛋白结合。由于钴胺素必须从食物中摄取，任何导致胃功能损伤的病症，例如胃肠炎或导致胃萎缩的病症，或不能产生结合咕啉、内因子、释放因子、TCⅡ或TCⅡ受体，都可能导致钴胺素摄取受损和缺乏。某些人群，如老人、孕妇、患慢性或急性胃肠炎患者、某些自身免疫疾病患者、有恶性贫血家族史的人和AIDS患者特别容易缺乏钴胺素。钴胺素不足的临床表现多种多样，但主要包括贫血、巨成红细胞血症和神经系统功能结构紊乱。约60％诊断为钴胺素不足的人有贫血，但大部分观察到的临床信号只有神经症状。约10％患者有精神病症状，约40％患者有神经和精神症状。早期诊断出钴胺素不足对确保患者良好预后非常重要，因为钴胺素缺乏的一些表现(尤其是神经精神作用)是不可逆的(若没有检测到)，且用钴胺素治疗能很快减轻。因此需要一种便利、有效的方法来精确地评估个体钴胺素水平，以确定个体是否患有钴胺素不足。已用总血浆钴胺素(即与运钴胺素(TC)蛋白Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ任一结合的钴胺素及其类似物)的测定来评估钴胺素的不足。这种方法得到一宽的基础浓度分布(被视为在人群中是正常的)，从而产生较宽的参考范围。然而在个体中，认为钴胺素的个体正常范围是非常窄的。已观察到，虽然当个体有代谢活性的钴胺素浓度超出其自身正常范围时，它们的总血浆钴胺素含量依旧认为在人群的正常范围中。这种情况下，就不能检测出钴胺素的不足。显然这种不可靠的方法是不理想的，且认为这种血清或血浆分析方法的诊断灵敏性和特异性均很低。已开发和使用了依赖于钴胺素生长的微生物的微生物分析方法，来测定血浆钴胺素浓度，但除了确定恰当参考范围有困难外，这些方法需要提取和转化钴胺素，这既耗时麻烦又不适于快速实验室筛选。其它钴胺素不足的分析方法包括测定血浆中需要钴胺素进行转变的代谢物的累积。在钴胺素不足个体的血浆中丙二酸二甲酯和血浆高半胱氨酸的水平升高(Chanarin，巨成红细胞贫血；London,Blackwell Scientific Publications,1991)，而且使与维生素B12相关的良性候选分子不足。已表明基于高半胱氨酸评估的方法是复杂而不实用的，而且精确性和灵敏性也很差。而基于丙二酸二甲酯测定的方法是精确而可靠的，但非常笨重而且还需要结合气相层析/质谱分析的分析手段，因此价格昂贵也不适于常规的临床筛选(Nexo等人(1994)Scand.J.Clin.Lab.Invest.54:61-76)。已有人建议用TCⅡ结合的钴胺素测定来替代血浆总钴胺素测定，其能提供钴胺素不足可能性的可靠临床指示(Herbert等人，(1990)Am.J.Hematol.34:132-139；Wickramasinghe和Fida(1993)J.Clin.Pathol.46:537-539；美国专利4680273)。然而这种测定holo-TCⅡ浓度的方法必须计算，不是直接得到的(计算血浆总钴胺素与TCⅡ去除后血浆钴胺素浓度之间的差异，评估holo-TCⅡ浓度)。可用硫酸铵(Carmel(1974)Am.J.Clin.Pathol.62:367-372)、微硅(microsilica)(Herzlich & Hubert(1988)Lab.Invest.58:332-337；Wickramasinghe & Fida(1993)J.Clin.Pathol.46:537-539)、微型细玻璃(Vu等人(1993)Am.J.Hematol.42:202-211)或固定的抗TCⅡ多克隆抗体(Lindemans等人(1983)Clin.Chim.Acta 132:53-61)吸收来去除这种TCⅡ。总血浆和去除部分中钴胺素的浓度可用本领域熟知的方法来测定，如放射和酶免疫分析方法。由于这些方法复杂而费时，它们不适于自动化或非自动化常规筛选，而且还因为所用吸收材料的特异性程度低，导致不能充分分离holo-TCⅡ和holo-HC，造成对holo-TCⅡ评估过高。吸附材料批与批之间的差异也将引入其它误差，最重要的是从一大容积减去另一大容积会导致不能接受的不精确性和不可靠性。另一评估TCⅡ的方法涉及利用其亲油性将TCⅡ与其它血清成分(包括TCⅠ和TCⅢ)分离。因此Kapel等人(1988)Clin.Chim.Acta 172:297-310,Benhayoun等人(1988)Acta Haematol.89:195-199和Toft等人(1994)Scand.J.Clin.Lab.Invest.54:62分别公开了用肝素琼脂糖、硅胶或纤维素将TCⅡ与其它运钴胺素蛋白分离的方法。然而由于它们依靠相同的吸附材料，这些方法也与间接方法有相同的缺点。而且由于holo-TCⅡ的低血浆浓度，使这些方法不适合于与已有的钴胺素定量方法联合。holo-TCⅡ的正常范围为35-160pM，低于35pM的测定值通常被认为表明钴胺素不足。大部分血浆钴胺素常规方法报道的分析灵敏度约为40pM,但实际上常常高得多，典型地约为90pM。因此，血浆holo-TCⅡ的正常水平低于或接近钴胺素定量常规方法的灵敏度界限本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于测定身体样品中结合运钴胺素蛋白的钴胺素的分析方法，其特征在于，所述的方法包括使体液的无细胞样品与固定的或可固定的ＴＣ Ⅱ特异性结合配体或结合钴胺素的ＴＣ Ⅱ（ｈｏｌｏ ＴＣ Ⅱ）相接触，将结合配体的组分与未结合配体的组分分开，和测定其中的ｈｏｌｏ－ＴＣⅡ或ＴＣ－Ⅱ结合的钴胺素的含量。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：E松德哈根，L奥宁，
申请(专利权)人：爱克西斯希尔德联合股份有限公司，
类型：发明
国别省市：NO[挪威]