电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶,其制法以及使用该凝胶的电泳法制造技术

本发明专利技术的电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，含有Ｔｒｉｓ和甘氨酸，或Ｔｒｉｓ、甘氨酸和一种以上的两性电解质以及一元酸，还含有调整至特定ｐＨ范围的凝胶缓冲液。上述凝胶，即使冷藏保存６个月以上，在用通用的莱姆理缓冲液进行蛋白质电泳的场合，或者在ＤＮＡ电泳时采用含通用的Ｔｒｉｓ、以及螯合剂，和醋酸、磷酸、硼酸中的任何一种酸的电泳用缓冲液，使ＤＮＡ进行电泳时，可以得到与制造后不久同样的分离能力和鲜明的电泳像。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
,其制法以及使用该凝胶的电泳法的制作方法
本专利技术涉及，其制法以及使用该凝胶的电泳法。，是蛋白质、糖质、脂质等构成生物体的重要物质的检测和定量分析试剂，在生物学、医学、水产学、兽医学等多个领域中作为基础研究手段而广泛使用。特别是，聚丙烯酰胺凝胶，由于是人工合成的物质，通过改变配方，容易制成分离特性不同的凝胶。因此，使用大量生产的预制凝胶，使预先具有各种分离特性，可以大大省略分析的时间，均匀而再现性良好，所以，在该领域，对生产及质量管理的贡献程度大。大量生产的预制凝胶，在供给它时，可以期待保存稳定性良好。早先，电泳用的聚丙烯酰胺凝胶，按照噢隆斯达尹〔L.Ornstein，Ann.N.Y.Acad.Sci.121，321～349(1964)〕和戴维斯〔B.J.Davis，Ann.N.Y.Acad.Sci，121，404～427(1964)〕提出的方法，以及，按照莱姆理〔U.K.Laemmli，Nature，227，680(1970)〕提出的方法，广泛用于蛋白质的生物化学医药分析，使用者制造凝胶加以使用。特别是莱姆理的方法，通过往凝胶和电泳用缓冲液中添加十二烷基硫酸钠(下面称作SDS)，可简便地推定蛋白质的分子量，得到广泛普及。莱姆理的方法，作为凝胶缓冲液，使用三(羟甲基)氨基甲烷(下面称作Tris)的盐酸部分中和物，作为电泳缓冲液，使用Tris及甘氨酸盐(莱姆理的电泳缓冲液)。在该法中，凝胶缓冲液，用盐酸部分中和Tris的约10～20％(摩尔)溶液，使pH达到8.8(莱姆理的凝酸缓冲液)。然而，在莱姆理的凝胶缓冲液的pH，酰胺基经受随时间而变的水解反应。凝胶的水解反应，因为即使在低温条件下也能进行，所以，聚丙烯酰胺凝胶部分具有阴离子基团。结果是，蛋白质的电泳距离变短，同时，分离像变得不鲜明，凝胶不可能长期保存。其次，粗略看一下核酸的电泳。随着分子生物学的进展，必须进行DNA、RNA的分析制备，然而，在这种核酸分析中，经常采用琼脂糖电泳法以及聚丙烯酰胺凝胶电泳法。核酸在中性缓冲液中显示带强阴电，其移动度，由于作为支持体的凝胶分子筛的效果，根据作为对象的核酸的大小，经常采用0.3～2％左右的琼脂糖凝胶或3.5％～20％左右的聚丙烯酰胺凝胶。琼脂糖凝胶，因为具有较大的孔径，可在高分子的核酸作为分离分析对象的场合使用。琼脂糖凝胶，因其电渗透的强弱、凝胶强度、熔点等的不同而有许多种类。另外，琼脂糖是天然产物，即使同一公司同一种产品，根据载荷，可以见到各种各样性状的差异。另外，在琼脂糖电泳法用于制备，精制DNA的场合，各种杂质混入琼脂糖中，限制酶、DNA聚合酶、DNA连接酶等酶活性受到阻碍，所以，要附加苯酚萃取等精制法。一方面，聚丙烯酰胺凝胶具有较小的孔径，可用于中分子～低分子核酸作为分离分析对象的场合。聚丙烯酰胺凝胶是合成的物质，具有化学高纯度，所以，未发现琼脂糖凝胶存在问题。另外，聚丙烯酰胺凝胶，通过改变配方，可容易地制出分离特性不同的凝胶。因此，采用大量生产的预制凝胶，使其预先具有各种分离能力，可大大省略分析时间，均匀而再现性良好，所以，在该领域对生产及质量管理的贡献程度大。大量生产的聚丙烯酰胺凝胶，在供给它时，可以期待保存稳定性良好。在用于DNA电泳的场合，琼脂糖凝胶以及聚丙烯酰胺凝胶的缓冲液，主要是含有pH7.8～8.3的乙二胺四醋酸(下面称作EDTA)或乙二胺四醋酸二钠(下面称作ETA)的三-醋酸缓冲液(下面称作TAE)、三-硼酸缓冲液(下面称作TBE)、三-磷酸缓冲液(下面称作TPE)，凝胶缓冲液是与电泳用缓冲液的组成相同的连续缓冲液体系。如上所述，大量生产的预制凝胶，在供给它时，可以期待保存稳定性良好。保存稳定性良好的凝胶的制造方法，是含有由Tris、两性电解质及酸构成的凝胶缓冲液，长期保存稳定性优良的，并且，可能测定的分子量范围显著扩大的聚丙烯酰胺凝胶的制造方法，已在特开平4-184163号公报中公开。采用该制造方法制造的聚丙烯酰胺电泳凝胶，可用于莱姆理电泳用缓冲液的分析，它是其中含有两性电解质pH4.0～7.5的凝胶缓冲液的凝胶，在其实施例中，举出pH6.9～7.4凝胶的制造，经过冷藏保存4个月，蛋白质的移动度未发生变化，是稳定的。凝胶缓冲液，目的是用于抑制聚丙烯酰胺凝胶的水解，将Tris的中和率设定在高值，另外，电泳凝胶中Tris的强酸部分和Tris的弱酸部分在边界附近的电位坡度变化，由于两性电解质的添加而变缓，和使用莱姆理的凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围。然而，含有pH6.9～7.4范围的凝胶缓冲液的聚丙烯酰胺凝胶，当经过冷藏保存5个月以上时，蛋白质的移动度出现变化。另外，在板状凝胶的情况下，聚丙烯酰胺凝胶其凝胶形状发生变化，玻璃极板易发生滑动。结果是，电泳分析时的操作困难，由于玻璃极板的滑动，还产生凝胶的剥离等问题。当凝胶缓冲胶的pH在6.8以下时，可以推测其保存稳定性更加提高。然而会出现电泳时间变长，分离能力恶化的问题，与使用莱姆理的凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围的聚丙烯酰胺凝胶无法得到。另外，在特表平9-512907号公报中，公开一种用于中性pH长寿命的预制电泳凝胶的体系。该体系的凝胶缓冲液含有pH在中性附近的一价有机胺或取代胺，用盐酸滴定至pH在约6～7之间。上述体系的电泳用缓冲液含有选自MOPS、MES、ACES、MOPSO、TES、HEPES及TAPSO所组成的族群中的两性离子，用氢氧化钠或有机碱滴定至pH约7。凝胶缓冲液、电泳用缓冲液是同时设定在中性，抑制聚丙烯酰胺凝胶的水解，同时，在蛋白质完全还原的状态下进行分离的缓冲液体系。上述电泳用体系，可以稳定12个月。然而，用特表平9-512907号公报中表示的体系，必须采用专用的分子量标记器。另外，特表平9-512907号公报表示的聚丙烯酰胺凝胶，当使用已知的电泳用缓冲液(例如，含有通用的甘氨酸的莱姆理电泳用缓冲液)时，电泳速度变得极慢，不可能在蛋白质的分离分析中使用。聚丙烯酰胺凝胶，如果pH设定在中性～酸性领域，可以把聚丙烯酰胺凝胶的水解抑制到某种程度，变成保存稳定性良好的电泳凝胶。因此，把pH设定在中性～酸性领域的聚丙烯酰胺凝胶，可把保管的有效期限设定长，作为预制凝胶，可以大量生产使预先具有各种分离特性。也就是说，，与作为蛋白质电泳法使用的电泳用缓冲液加以组合，进行DNA的分离分析，或者，与作为核酸电泳法通用的电泳用缓冲液加以组合，进行DNA的分离分析，如果都可能的话，使用者可以经济而有效地进行分析。为了解决上述课题，本专利技术的第一目的是提供一种冷藏保存6个月以上的蛋白质的分离能力以及凝胶形状同时稳定，并且与使用莱姆理凝胶缓冲液制成的凝胶测定对象具有同等的分级分子量范围的聚丙烯酰胺预制凝胶。为了解决上述课题，本专利技术的第二目的是提供一种使用冷藏保存6个月以上稳定的电泳用的聚丙烯酰胺凝胶和核酸分离分析通用的电泳用缓冲液，进行DNA鲜明的分离分析的电泳法。为了解决上述课题，本专利技术的第三目的是提供一种使用冷藏保存4个月以上稳定的可作为蛋白质分析用的电泳用的聚丙烯酰胺凝胶和蛋白质分析用的电泳用缓冲液，进行DNA鲜明的分离分析的电泳法。本专利技术涉及一种，其特征是，在用于电泳用缓冲液的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种电泳用的聚丙烯酰胺预制凝胶，在该用于电泳法的预制凝胶中，含有的电泳用缓冲液是其组成为含三（羟甲基）氨基甲烷及两性电解质的水溶液，其特征是， （１）三（羟甲基）氨基甲烷的浓度为０．０７ｍｏｌ／１～０．２ｍｏｌ／ｌ， （２）两性电解质由甘氨酸和１种以上的共存两性电解质所构成， （ａ）上述共存两性电解质的碱基解离常数范围为８．３＜ｐＫｂ＜９．６， （ｂ）上述共存两性电解质的添加量，相对于上述甘氨酸为０．１～３０％（摩尔）， （ｃ）上述共存两性电解质和上述甘氨酸的总浓度为０．１～０．３ｍｏｌ／ｌ，以及， （３）采用ｐＨ６．０～６．８范围的缓冲液进行配制。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：铃木美香，
申请(专利权)人：海茂株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]