一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法技术

本发明专利技术涉及一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，步骤是：(1)测定荧光供体和受体在同一激发波长下、两个检测波长处的荧光强度，然后以两个波长的荧光强度比值作为信号值；(2)通过测量反应起始阶段至少两个时刻的信号值，通过线性拟合、四参数拟合，分别建立信号强度的绝对值、信号变化的速率值与样品浓度的标准曲线；(3)检测未知样本的信号值，通过标准曲线，根据未知样本的荧光强度，获得未知样本的浓度，从而避免hook效应。利用信号强度绝对值和信号变化速率值与背景信号的比值，计算相对信号强度和信号变化速率相对值，在不同仪器上实现一致的结果。可以在既定时间内完成更多样品的浓度判读，从而使系统具有更高检测通量。

【技术实现步骤摘要】
一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法
本专利技术涉及一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，属于荧光免疫检测

技术介绍
均相时间分辨荧光免疫分析技术结合了荧光共振能量转移(FRET，FluorescenceResonanceEnergyTransfer)和时间分辨荧光(TRF，TimeResolvedFluorescence)两种技术。该技术是利用了具有穴状结构的稀土元素的螯合标记物作为荧光供体，以及与荧光供体具有良好光谱重叠的短寿命荧光分子作为荧光受体，在稀土元素穴状化合物的供体与受体(第二荧光标记物)之间发生荧光共振能量转移(FRET)。在荧光共振能量转移中，受体发射荧光的寿命等同于供体的发射荧光的寿命。因为供体荧光衰减周期较长，所以供体会诱导受体长时间地发射荧光，受体激发后产生的荧光便能持续较长时间，这样通过时间分辨就可以区分那些短寿命的自身散射的荧光，这样从短寿命荧光背景中就很容易区分出FRET信号。钩状效应(hookeffect)是类同于沉淀反应中抗原过剩的后滞现象，当标本中待测抗原浓度相当高时，过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合，而不再形成夹心复合物，所得结果将低于实际含量。钩状效应严重时甚至可出现假阴性结果。正常浓度下信号随浓度升高，产生钩状效应时，信号不再随浓度增加。均相时间分辨荧光免疫分析采用一步法测试，受到钩状效应影响尤为明显，如图1所示，该图是反应终点时信号与浓度的关系，显然高浓度会造成测量结果偏低，为避免这种结果，需要判断钩状效应的存在。应用均相时间分辨荧光免疫分析技术用于临床诊断，由于临床标本浓度变化动态范围大，因此必须要开发一种识别高浓度标本即hook效应的技术，才能满足临床使用要求。(Eliminationof"hook-effect"intwo-siteimmunoradiometricassaysbykineticrateanalysis，KLHoffmanet.al.)《Clin.Chem.》30/9，1499-1501(1984)公开了利用两个时间点的定标曲线浓度差异判断放射免疫法钩状效应的方法，该方法采用2min和10min两个时刻定量曲线，判断钩状效应，利用了放免的特点在第一次读数时不清洗，第二次终读数时清洗。缺点是需在两个固定时刻测量，且只适合放免。公开号为CN105339794A的中国专利申请涉及用于检测光度测定法的前带效应的方法，该方法适用于光度法(免疫浊度法)，在反应初始阶段测量四次信号，通过一定算法进行判读。缺点是适用于浊度法，四次测量次数较多，占用检测系统。公开号为CN102944672A的中国专利申请涉及采用光激发化学发光免疫分析对血清中的待测靶物质进行定性与定量检测的方法，该方法通过在反应终点读数后，加入一定靶物质再继续反应后二次读数，通过两次读数差异判断。缺点：加入靶物质带来额外试剂消耗，增加成本；在反应结束时才能判断。以上技术适用于特定的免疫学方法，并不适合于均相时间分辨荧光免疫分析。目前用于临床的国外产品仅有赛默飞世尔的Kryptor系列产品，尚未检索到其判断hook效应的专利，从公开资料看，其采用检测免疫反应初始阶段60s内反应动力学曲线进而判断样品是否浓度过高需要稀释，需要在9个时间点进行读数，这会造成检测系统长时间被占用，影响检测通量。
技术实现思路
为了克服现有技术的不足，本专利技术的目的是提供一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，较少使用检测系统，可以在既定时间内完成更多样品的浓度判读，从而使系统具有更高检测通量。为实现上述专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，同时测定荧光供体和受体在两个检测波长的荧光强度，然后以两个波长的荧光强度比值作为本专利技术信号强度的绝对值。进一步，可以利用信号强度绝对值和信号变化速率值与背景信号的比值，计算相对信号强度和信号变化速率相对值，可以在不同仪器上实现一致的结果(图2)。具体而言，激发波长采用中心波长320nm，检测波长采用中心波长620nm和665nm，以665nm和620nm的荧光强度比值，作为信号强度的绝对值；通过测量反应起始阶段至少两个时刻的信号值，通过线性拟合、四参数拟合，分别建立信号强度的绝对值和信号变化的速率值与浓度的标准曲线；检测未知样本的信号强度的绝对值，通过标准曲线，根据未知样本的荧光强度，获得未知样本的浓度，从而避免hook效应。测量时间是在反应的起始阶段，在至少两个时刻，可以是20s到10分钟，优选的是20s到2分钟。两个时刻的差值是计算反应动力学速率的时间差，时间差取值范围从2秒到10分钟，优选6-60秒。通过比较两条曲线得到的待测物质的浓度差异，可以判断样本的浓度水平。为使拟合曲线在不同仪器上适用，将测量信号除以阴性标本的背景信号，可以获得相对信号，相对信号只与反应进行的程度有关。计算测量信号的绝对值与浓度的关系时，可采用单次测量的信号，或者多次测量的信号平均值，测量速率时可采用单个速率值或多次测量的速率值的平均值。当未知样品的信号值和速率值均低于预设标准时，判断为浓度处于正常范围。当未知样品按照两条测量曲线进行计算时，如果得到的浓度值差异，小于预设值则样品不存在钩状效应。当两条曲线计算得到的浓度存在显著差异时(超出预设值)，则样品中存在钩状效应。存在钩状效应时，利用钩状效应时，信号与浓度的关系，可计算浓度水平。本专利技术有以下积极的效果：通过测量反应起始阶段至少两个时刻的信号值，分别建立信号强度的绝对值和信号变化的速率值与浓度的关系，计算样本浓度，从而判断hook效应。进一步可以利用信号强度绝对值和信号变化速率值与背景信号的比值，计算相对信号强度和信号变化速率相对值，可以在不同仪器上实现一致的结果，使系统具有更高检测通量。附图说明图1是钩状效应检测结果示意图(当浓度小于1000ng/mL时，信号与浓度呈正比；当浓度大于1000ng/mL时，信号与浓度呈反比)。图2是信号绝对值和反应速率与浓度的关系图。图3是实施例1的信号绝对值与浓度关系(浓度达到80000ng/mL时产生钩状效应)。图4是实施例1的速率值与浓度的关系(浓度达到16000ng/mL时产生钩状效应)。图5是实施例2不同系统(仪器)间信号绝对值与浓度关系(浓度达到80000ng/mL时产生钩状效应)。图6是信号绝对值与速率值与背景值比值与浓度的关系(■为RS，●为RRR)。具体实施方式下面结合具体实施方式对本专利技术做进一步的详细说明。以下实施例所需检测条件：1、仪器：具有多波长时间分辨荧光，检测功能的仪器，进行测定，例如帝肯的多功能酶标仪F200，也可采用具备全自动加样功能的测量仪器2、测量程序：检测体系包括待测样本、反应试剂r1和反应试剂r2组成，两种试剂分别标记荧光供体和荧光受体，其中，荧光供体本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，/n测定荧光供体和受体在同一激发波长下、两个检测波长处的荧光强度，然后以两个波长的荧光强度比值作为信号值；/n通过测量反应起始阶段至少两个时刻的信号值，通过线性拟合、四参数拟合，分别建立信号强度的绝对值与样品浓度的标准曲线、信号变化的速率值与样品浓度的标准曲线；/n检测未知样本的信号值，通过标准曲线，根据未知样本的荧光强度，获得未知样本的浓度，从而避免hook效应。/n

【技术特征摘要】
1.一种判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，
测定荧光供体和受体在同一激发波长下、两个检测波长处的荧光强度，然后以两个波长的荧光强度比值作为信号值；
通过测量反应起始阶段至少两个时刻的信号值，通过线性拟合、四参数拟合，分别建立信号强度的绝对值与样品浓度的标准曲线、信号变化的速率值与样品浓度的标准曲线；
检测未知样本的信号值，通过标准曲线，根据未知样本的荧光强度，获得未知样本的浓度，从而避免hook效应。


2.根据权利要求1所述的判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，利用信号强度绝对值和信号变化速率值与背景信号的比值，计算相对信号强度和信号变化速率相对值，在不同仪器上实现一致的结果。


3.根据权利要求1所述的判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状效应的方法，其特征在于，所述的激发波长采用中心波长320nm，检测波长采用中心波长620nm和665nm，以665nm和620nm的荧光强度比值，作为信号值；
测量时间是在反应的起始阶段，在至少两个时刻，可以是20s到10分钟；
两个时刻的差值是计算反应动力学速率的时间差，时间差取值范围从2秒到10分钟。


4.根据权利要求1所述的判断均相时间分辨荧光免疫分析钩状...

【专利技术属性】
技术研发人员：刘涛，
申请(专利权)人：中国科学院苏州生物医学工程技术研究所，
类型：发明
国别省市：江苏;32