本发明专利技术公开了一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基。本发明专利技术方法包括分阶段培养所述hiPSC诱导其神经分化，所述阶段包括：阶段a.共培养所述hiPSC与骨髓基质细胞HS5于诱导培养基；阶段b.用HS5条件培养基连续培养所述hiPSC；阶段c.用培养神经元细胞的基础培养基继续培养所述hiPSC。本发明专利技术的方法诱导人类hiPSC细胞定向分化为神经系统细胞，同时抑制非神经系统细胞的生成，从而获得成熟、广谱的神经细胞群。该神经细胞群不仅经过体外验证为具有电冲动发放的成熟神经元，而且这类神经细胞群在小鼠体内实验中也被证实，具有有效的治疗神经系统疾病(如脑卒中、脑损伤)的作用。
【技术实现步骤摘要】
定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基本申请是申请日为2017年07月28日申请号为201710632172.4、专利技术创造名称为“定向诱导hiPSC分化后的神经细胞体系、诱导方法及应用”的专利申请的分案申请。
本专利技术属于神经生物学领域，具体涉及定向诱导hiPSC分化后的神经细胞体系、诱导方法及应用。
技术介绍
人诱导多能干细胞(humaninducedpluripotentstemcells,hiPSC)来源的神经细胞对于细胞移植治疗缺血性脑卒中(以多种不同种系的神经细胞严重缺失为特点)具有显著效应。然而，现有的诱导hiPSC细胞分化为神经细胞的操作效率低，稳定性差。干细胞生物学的最新研究进展为再生医学提供了依据，其中hiPSC细胞的定向分化可以为细胞移植治疗缺血性脑卒中(以各种神经元和神经胶质细胞的严重缺损为特性)患者提供了多种人类神经细胞。有效地诱导、纯化和植入人类神经细胞是建立以hiPSC细胞为基础的神经细胞疗法所必需的。许多有关高效分化神经细胞的方法草案已被提出。然而，这些方法不足以提供成熟的神经细胞谱系，致使幼稚细胞混杂于其中，导致脑内移植后畸胎瘤的形成。此外，某些方法只能分化产生一个窄谱的神经细胞系，不能满足治疗缺血性脑卒中所需的多种细胞类型。更重要的是，为将hiPSC细胞诱导的神经细胞应用于临床，诱导而来的神经系统细胞的分离纯化，以剔除非神经系统细胞及幼稚细胞是非常必要的。因此，建立基于hiPSC细胞的神经诱导和纯化系统已被人们期待已久(Rov,N.S.；Cleren,C.；Singh,S.K.；Yang,L.；Beal,M.F.；Goldman,S.A.FunctionalengraftmentofhumanEScell-deriveddopaminergicneuronsenrichedbycoculturewithtelomerase-immortalizedmidbrainastrocytes.Nat.Med.12:1259–1268；2006；Yan,Y.P.；Yang,D.L.；Zarnowska,E.D.；Du,Z.W.；Werbel,B.；Valliere,C.；Pearce,R.A.；Thomson,J.A.；Zhang,S.C.Directeddifferentiationofdopaminergicneuronalsubtypesfromhumanembryonicstemcells.StemCells23:781–790；2005；Gerrard,L.；Rodgers,L.；Cui,W.Differentiationofhumanembryonicstemcellstoneurallineagesinadherentculturebyblockingbonemorphogeneticproteinsignaling.StemCells23:1234–1241；2005；Keirstead,H.S.；Nistor,G.；Bernal,G.；Totoiu,M.；Cloutier,F.；Sharp,K.；Steward,O.Humanembryonicstemcell-derivedoligodendrocyteprogenitorcelltransplantsremyelinateandrestorelocomotionafterspinalcordinjury.J.Neurosci.25:4694–4705；2005.)。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题是为了克服目前现有技术提供的神经细胞谱系不成熟，致使幼稚细胞混杂于其中导致脑内移植后畸胎瘤形成的不足，提供一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的方法、制得的神经细胞体系及其应用。本专利技术的方法诱导人类hiPSC细胞定向分化为神经系统细胞，同时抑制非神经系统细胞的生成，从而获得成熟、广谱的神经细胞群。该神经细胞群不仅经过体外验证为具有电冲动发放的成熟神经元，而且这类神经细胞群在小鼠体内实验中也被证实，具有有效的治疗神经系统疾病(如脑卒中、脑损伤)的作用。本专利技术解决上述问题的技术方案之一是：一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的方法，其包括分阶段培养所述hiPSC诱导其神经分化，所述阶段包括：阶段a.共培养所述hiPSC与骨髓基质细胞HS5于诱导培养基；阶段b.用HS5条件培养基、即含有所述HS5的分泌液的诱导培养基连续培养所述hiPSC；阶段c.用培养神经元细胞的基础培养基继续培养所述hiPSC。其中，阶段a中所述的所述诱导培养基为本领域常规的诱导培养基；较佳地，所述诱导培养基包括下述组分：20-25％血清替代品、0.5-1.5mM的谷氨酰胺、8-20ng/ml表皮生长因子、8-12ng/ml脑源性神经营养因子、8-15ng/ml神经营养因子-3、0.5-1.5ng/ml转化生长因子β3、400～700ng/ml头蛋白以及2-3％B27添加剂的DMEM/F12培养基，所述百分比为体积百分比。更佳地，为了在干细胞向神经细胞谱系分化的过程中有效地同步促进细胞分化产物的增殖活性，所述诱导培养基还包括1-1.5％非必需氨基酸、8-15ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、0.08-0.15mMβ-巯基乙醇以及0.3-0.8mM双丁酰环磷酸腺苷。进一步更佳地，所述培养基包括下述组分：20％血清替代品、1％非必需氨基酸、1mM的谷氨酰胺、0.1mMβ-巯基乙醇、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子、10ng/ml表皮生长因子、10ng/ml脑源性神经营养因子、10ng/ml神经营养因子-3、1ng/ml转化生长因子β3、0.5mM双丁酰环磷酸腺苷、500ng/ml头蛋白以及2％B27细胞培养添加剂DMEM/F12培养基。所述的血清替代品优选为KnockOutTM血清替代品。阶段a中所述的共培养可以为直接接触共培养或者非直接接触共培养，较佳地为直接接触共培养。阶段a中所述的骨髓基质细胞HS5为抑制分裂的HS5；较佳地，所述抑制分裂的方法为照射；更佳地，所述照射的条件为：γ射线辐照强度75-85Gy，照射时间为28-35分钟，所述的辐照强度优选为80Gy，所述的照射时间优选为30分钟。阶段a中所述的共培养的时间为本领域常规，较佳地为10-18天，更佳地为2周。阶段b中所述的连续培养的时间为本领域常规，较佳地为8-18天，更佳地为2周。阶段c中所述的继续培养的时间为本领域常规，较佳地为10-18天，更佳地为2周。阶段b中所述的HS5条件培养基的制备方法为1)将5×106～2×107个经照射后的HS5细胞接种到8-15ml所述诱导培养基中；2)连续1～8天收集培养细胞的上清；3)将上清与所述诱导培养基以1:1～8:1比例混合即得；更佳地，所述HS5条件培养基的制备方法为：1)将1×107个经照射后的HS5细胞接种到10ml所述诱导培养基中；2)连续4天收集培养细胞的上清；3)将上清与所述诱导培养基以1:1比例混合即得。阶段本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基，其特征在于，其为含有骨髓基质细胞HS5的分泌液的诱导培养基；所述HS5为经过照射的HS5；所述照射的条件为：γ射线辐照强度75-85Gy，照射时间为28-35分钟；/n所述诱导培养基为包括下述组分：20-25％血清替代品、0.5-1.5mM的谷氨酰胺、8-20ng/ml表皮生长因子、8-12ng/ml脑源性神经营养因子、8-15ng/ml神经营养因子-3、0.5-1.5ng/ml转化生长因子β3、400～700ng/ml头蛋白以及2-3％B27添加剂的DMEM/F12培养基，所述百分比为体积百分比。/n
【技术特征摘要】
1.一种定向诱导hiPSC分化为神经细胞体系的HS5条件培养基，其特征在于，其为含有骨髓基质细胞HS5的分泌液的诱导培养基；所述HS5为经过照射的HS5；所述照射的条件为：γ射线辐照强度75-85Gy，照射时间为28-35分钟；
所述诱导培养基为包括下述组分：20-25％血清替代品、0.5-1.5mM的谷氨酰胺、8-20ng/ml表皮生长因子、8-12ng/ml脑源性神经营养因子、8-15ng/ml神经营养因子-3、0.5-1.5ng/ml转化生长因子β3、400～700ng/ml头蛋白以及2-3％B27添加剂的DMEM/F12培养基，所述百分比为体积百分比。
2.如权利要求1所述的HS5条件培养基...
【专利技术属性】
技术研发人员：杨涛，隋昳，
申请(专利权)人：杨涛，
类型：发明
国别省市：上海;31
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。