一种新的有效地激活和扩增T细胞的方法技术

本发明专利技术公开了一种使用单体单链双特异性抗体有效地激活和扩增T细胞的方法，该方法不需要使用复杂的被抗体偶联的细微珠粒，不需要使用经基因工程改造的辅助细胞，不需要使用抗体包被的细胞培养皿。这种单体单链双特异性抗体激活和扩增的T细胞可以被慢病毒有效转导并发挥细胞毒作用。

【技术实现步骤摘要】
一种新的有效地激活和扩增T细胞的方法专利
本专利技术涉及T细胞免疫治疗领域。具体地说，本专利技术涉及一种新的有效地激活和扩增T细胞的方法。该方法不需要辅助细胞，不需要吸附抗体的固体介质和不需要使用偶联着抗体的细微珠粒。用该方法激活和扩增的T细胞可用于T细胞免疫治疗。技术背景T细胞免疫疗法是一种新兴的非常有前景的治疗疾病的方法(KamphorstAO，2013)。例如，自体移植由基因工程改造的表达嵌合抗原受体(CAR)的T细胞，一种当前最热门的T细胞免疫疗法(CART免疫疗法)，在前期临床研究中已显示出巨大的治疗慢性或急性淋巴细胞白血病的希望(Kalos，M，2011；Maus，M.V，2014)。T细胞免疫疗法通常涉及T细胞的离体激活和扩增。T细胞被激活是T细胞能被嵌合抗原受体(CAR)基因工程改造的的前提(XiuyanWang，2016)。但是，现有的激活和扩增T细胞的方法都存在这样或那样的缺点或限制。目前有以下几种激活和扩增T细胞的方法：i)第一种方法是使用树突状细胞激活和扩增T细胞，这是一种基于细胞的T细胞激活和扩增方法。树突状细胞原本是T细胞的天然内源性激活剂(PetraKleindienst，2003)，但树突状细胞对T细胞的激活效力因个体不同而有很大的差异，这种特性极大地限制了树突状细胞在T细胞激活和扩增中的进一步应用；ii)第二种基于细胞的方法是通过制造出人工抗原递里细胞(artificialantigen-presentingcells，AAPC)来激活和扩增T细胞，例如，通过基因工程的方法制造表达特定抗原的K562细胞，经过同位素辐射照射过的表达特定抗原的K562细胞便可以作为人工抗原递呈细胞来激活和扩增T细胞(TNumbenjapon，2006)，然而，选择和生产HLA亚型匹配的GMP级人工抗原递呈细胞是一个非常复杂的过程(SinghH，2014)；iii)用抗CD3抗体和抗CD28抗体包被的细胞培养皿也可以用来激活和扩增T细胞(WalkerMR，2003)，然而，细胞培养皿的抗体包被效率在不同批次之间有很大差异，这种差异会进一步导致T细胞在激活和扩增上产生差异，这不利于这种方法应用于临床治疗；iv)一些生物技术公司研发出的细微珠粒也可用于T细胞的激活和扩增，这些细微珠粒表面偶联着抗CD3抗体和抗CD28抗体，市场上常见的细微珠粒包括GibcoDynabeadsHumanT-ActivatorCD3/CD28(Cat#111.61D，ThermoFisherScientific)细微珠粒和MiltenyiMACSGMPTransActCD3/28细微珠粒(Cat#130-020-008，MiltenyiBiotech)，然而，使用GibcoDynabeads激活和扩增的T细胞在输注患者之前需要分离和去除这些细微珠粒，常用的分离和去除细微珠粒方法虽然可以大大减少T细胞中残留的细微珠粒数量，但不能完全消除这些细微珠粒，这会导致一些残余的细微珠粒被输注到患者的体内，细微珠粒去除的过程也会减少可用于治疗的T细胞数量，因为许多T细胞在分离过程中仍然会与细微珠粒紧密粘在一起。MiltenyiTransActCD3/CD28细微珠粒是由可生物降解的材料制成，但是，可生物降解的GMP级细微珠粒的生产和选择是复杂且昂贵的过程，为了能应用于临床T细胞免疫治疗，复杂的制造过程必需进行必要的简化以促进生产标准化，此外，在病人体内使用可生物降解的TransActCD3/28细微珠粒也将面临许多来自监管机构在安全方面的质询；v)美国专利申清(US20070036783A1)报道了使用可溶性复合物来激活和扩增T细胞，这种可溶性复合物是四聚体抗体复合物，四聚体抗体复合物的制备方法很复杂，四聚体抗体复合物的组分在不同生产批次中也必然会有差异。上述这些激活和扩增T细胞的方法都存在这样或那样的缺点或限制。使用本专利技术的单体单链双特异性抗体来激活和扩增T细胞就可以克服上述这些缺点或限制。本专利技术的单体单链双特异性抗体通过同时提供主要刺激信号和辅助刺激信号来激活和扩增T细胞。本专利技术的单体单链双特异性抗体具有显著的优势：i)如本专利申请的附图1所示，单体单链双特异性抗体结构简单易于生产，而人工抗原递里细胞，GibcoDynabeadsHumanT-ActivatorCD3/CD28细微珠粒和MiltenyiMACSGMPTransActCD3/28细微珠粒的结构复杂不易于生产；ii)单体单链双特异性抗体是一种可溶性和具有固定细成成分的试剂，而人工抗原递呈细胞，GibcoDynabeadsHumanT-ActivatorCD3/CD28细微珠粒和MiltenyiMACSGMPTransActCD3/28细微珠粒的组成成分在个批次间均可能有差异；iii)单体单链双特异性抗体是一种单体试剂，而GibcoDynabeadsHumanT-ActivatorCD3/CD28细微珠粒和MiltenyiMACSGMPTransActCD3/28细微珠粒是复合体，复合体形式细微珠粒的生产成本明显高于单体单链双特异性抗体的生产成本；iv)单体单链双特异性抗体可以通过简单的过滤方式来进行无菌处理，而人工抗原递里细胞，GibcoDynabeadsHumanT-ActivatorCD3/CD28细微珠粒和MiltenyiMACSGMPTransActCD3/28细微珠粒不可以通过简单的过滤方式来进行无菌处理，它们的无菌处理工艺繁琐复杂；v)如本专利技术所公开，单体单链双特异性抗体激活和扩增的T细胞可以被慢病毒有效地转导，并且可以有效地实施在T细胞免疫治疗中起关键作用的抗原特异性细胞毒性作用。
技术实现思路
本专利技术公开了一种可有效地激活和扩增T细胞的双特异性抗体。这种双特异性抗体是一种单体单链形式的抗体(其结构详见附图1)，它可以简单地通过5个氨基酸的间隔区把两个T细胞抗原结合域(如抗CD28抗体单链可变片段和抗CD3抗体单链可变片段)连接在一起而构成。本专利技术简化了T细胞激活和扩增的程序并可降低T细胞免疫治疗的费用。附图说明以下将结合附图对本专利技术的优选实施例进行详细的描述。应当理解，优选实施例仅为了说明本专利技术，而不是为了限制本专利技术的保护范围。图1单体单链双特异性抗体结构。图1A单体单链双特异性抗体的一般性结构，它由第一T细胞抗原结合域，接头，第二T细胞抗原结合域，接头和亲和标签组成。图1B优选实施例抗CD28/CD3单体单链双特异性抗体的结构，本专利技术以它作为单体单链双特异性抗体的一个优选实施例。抗CD28/CD3单体单链双特异性抗体由抗CD28抗原的抗体轻链可变区(CD28L)，接头，抗CD28抗原的抗体重链可变区(CD28H)，接头，抗CD3抗原的抗体重链可变区(CD3H)，接头，抗CD3抗原的抗体轻链可变区(CD3L)和亲和标签组成。H：抗体重链可变区；L：抗体轻链可变区；亲和标签：用于检测和纯化.图2优选实施例抗CD28/CD3单体单链双特异性抗体的DNA序列。图3抗CD28CH2CH3抗体和抗CD3CH2CH3抗体的功能鉴定本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种使用单体单链双特异性抗体激活和扩增T细胞的方法，该单体单链双特异性抗体是包含两个抗原结合结构域的单链多肽，其中一个抗原结合结构域提供主要激活信号，另一个抗原结合域提供辅助刺激信号。/n

【技术特征摘要】
1.一种使用单体单链双特异性抗体激活和扩增T细胞的方法，该单体单链双特异性抗体是包含两个抗原结...

【专利技术属性】
技术研发人员：周文云，
申请(专利权)人：周文云，
类型：发明
国别省市：江西;36