恶性肿瘤早期诊断的蛋白芯片制造技术

本发明专利技术恶性肿瘤早期诊断的蛋白芯片涉及一种蛋白质芯片，其利用高速全自动点样机器人把多种肿瘤标记物抗体及阳性对照、阴性对照点阵于蛋白芯片的同一腔室内，蛋白质通过化学键连接于固相载体上，所述阳性对照为对应肿瘤标志物，阴性对照为人血清白蛋白。使用本发明专利技术不仅可以具有灵敏度高、特异性强、结果稳定、重复性好等优点，而且操作简便、一次即可，即方便了医务工作者，提高了劳动效率，节省国家财力，又使患者在省钱的同时更早诊更早治，提高治愈率，同时，把相关指标高度集成，能提高判断的准确性，特别利于早期诊断。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术恶性肿瘤早期诊断的蛋白芯片涉及一种蛋白质芯片，蛋白质芯片技术是将蛋白或多肽有序地点阵在固体片基上，利用免疫学方法对蛋白质进行检测、识别、鉴定的新兴技术。具有体积小，信息含量高、并可依不同需要进行组合设计等特点。
技术介绍
近年来，恶性肿瘤已成为危害人类健康的常见病，多发病。它不仅对患者生命造成威胁，且治疗费用高昂。但是恶性肿瘤并非不治之症，只要及早发现，尽早治疗，治愈率可达90％以上，尽早治疗的费用也相对极其低廉。所以目前世界许多科学工作者都致力于恶性肿瘤早期诊断工作。现有临床进行恶性肿瘤早期诊断的方法分为两类一，免疫学检测；二，分子生物学检测。免疫学检测包括1，酶免技术；2，荧光免疫检测；3，放射免疫检测；4，免疫细胞化学检测。分子生物学检测主要是指基因诊断技术。目前临床常用的免疫学方法检测试剂盒多是多种肿瘤标志物。其中，肿瘤标志物是肿瘤组织产生或机体对肿瘤组织的反应而产生的物质的逐一检测，存在操作复杂、重复、费时、费力、费钱等缺点。然而，最近新出的肿瘤特异性生长因子(Tumor Specific GrowthFactor，TSGF)试剂盒在早早癌诊断上有一定作用，但其最大的缺点是不能检测出到底是哪个部位发生了恶性肿瘤，需借助超声波、核磁共振等物理方法或用其他有器官特异性肿瘤标志物配合检测以确定病变部位。而分子生物学检测需聚合酶链反应(PCR)等烦复操作，且PCR容易产生假阳性，是一种不可靠的方法。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种通过一次检测，既可检出被检者体内是否存在恶性肿瘤，而且可以直接判定肿瘤到底发生于患体内哪个部位的恶性肿瘤早期诊断的蛋白芯片。本专利技术的目的可通过下述技术方案实现本专利技术利用高速全自动点样机器人把多种肿瘤标记物抗体及阳性对照(对应肿瘤标志物)、阴性对照(人血清白蛋白)点阵于蛋白芯片的同一腔室内，蛋白质通过化学键连接于固相载体上固定。本专利技术固相载体如活性基团修饰的玻璃片等。在上述方案基础上，多种肿瘤标记物抗体能特异结合最普遍存在于众多恶性肿瘤中的肿瘤标志物，将其以及阳性对照点在一个芯片上制成普通型恶性肿瘤早期诊断的蛋白芯片，应用于体检普查，通过一次检测，既可检出被检者体内是否存在恶性肿瘤，而且可以直接判定肿瘤到底发生于患体内的哪个部位。在上述方案基础上，多种肿瘤标记物抗体是按人体器官分类，每一类分别点上一种器官常发的恶性肿瘤对应的肿瘤标记物的抗体，制成临床检测型恶性肿瘤早期诊断的蛋白芯片，可以依据临床需要按病人不适部位进行，也是一次检测即可达到检测目的。本专利技术用于检测病人血清中的肿瘤标志物，是将病人血清滴加于芯片表面，血清中的肿瘤标志物分别与固定在芯片上的相应抗体结合，洗去末结合的其他物质后，按设计一，加入荧光标记的抗肿瘤标记物抗体混合物，反应后洗去未结合者，样品点的荧光强度与血清中的肿瘤标记物的含量成正相关，如图1双抗体夹心法原理图所示。本专利技术用于检测病人血清中的肿瘤标志物，按设计二，可在血清反应后，加入生物素标记的抗肿瘤标记物抗体混合物，反应后洗去未结合物，再加入荧光标记的亲和素链亲和素，反应后洗去未结合者，点样点的荧光强度与血清中的肿瘤标志物的含量呈正相关。设计二与设计一相比，设计二具有信号放大作用，提高了检测灵敏度。如图2引入生物素放大系统的原理图所示。本专利技术制备方法第一步点样、制作技术(1)根据样品数量设计适当的阵列排布，使用高速全自动点样机器人把多种肿瘤标记物抗体1及阳性对照物(对应肿瘤标志物)、阴性对照(人血清蛋白)点阵于蛋白芯片的同一腔室内；(2)室温常温(25℃左右)过夜，使蛋白质的氨基与玻璃片上的醛基发生缩合反应，以固定样品；(3)利用制作蛋白芯片的常规方法进行封闭、洗涤、干燥、包装、保存。本专利技术的杂交反应有下述二种方法方法一(1)在点好的蛋白芯片上滴加待检血清，37℃孵育1小时；(2)用低浓度钠盐洗去多余样品；(3)加封闭液进行封闭，再次洗脱并晾干；(4)滴加封闭液稀释过的荧光标记的多种肿瘤标记物抗体2混合物，37℃摄氏度孵育半小时后洗去未结合物并晾干。方法二(1)在点好的蛋白芯片上滴加待检血清，37摄氏度孵育1小时。(2)用低浓度钠盐洗去多余样品。(3)加封闭液进行封闭，再次洗脱并晾干。(4)滴加封闭液稀释过的以生物素标记的肿瘤标记物抗体2混合物，37摄氏度孵育半小时后洗去未结合物并晾干。(5)滴加封闭液稀释过的荧光标记亲和素/链亲和素，37摄氏度孵育半小时后洗去未结合物并晾干。结果检测反应结束后，利用专业的芯片扫描分析仪进行结果的判读和分析。本专利技术的优越性在于使用本专利技术不仅可以具有灵敏度高、特异性强、结果稳定、重复性好等优点，而且操作简便、一次即可，既方便了医务工作者，提高了劳动效率，节省国家财力，又使患者在省钱的同时更早诊更早治，提高治愈率。同时，把相关指标高度集成，能提高判断的准确性，特别利于早期诊断。附图说明附图1，双抗体夹心法原理图。附图2，引入生物素放大系统的原理图。附图3，肝癌诊断蛋白质芯片。附图4，胰腺癌诊断芯片。具体实施方法实施例一，如图3一种肝癌诊断蛋白质芯片所示，其中，A1抗甲胎蛋白(AFP)抗体A2抗γ-谷氨酰转肽酶同工酶(γ-GT)I’，II，II’抗体A3抗异常凝血酶原(DPC)抗体A4抗α-L岩藻糖苷酶抗体B1抗5’-核苷酸磷酸二酯酶同工酶V、VI抗体B2抗胎盘型谷胱甘肽S转移酶抗体B3抗α1-抗糜蛋白酶抗体B4抗铁蛋白抗体C1抗酸性同工铁蛋白抗体C2抗乙肝表面抗原抗体C3丙型肝炎抗原D1阳性对照D2阴性对照迄今为止，AFP仍是诊断肝癌的主要实验指标。但是部分良性肝病、生殖系统畸胎瘤和胃肠道的一些恶性肿瘤AFP也可升高，而另一些肝细胞癌患者AFP始终持续是低浓度，检出困难。我们用1、抗人LCA(小扁豆凝集素)结合型AFP单克隆抗体；2、抗人伴刀豆球蛋白(ConA)结合型AFP抗体；3、抗人AFP抗体点样。抗人LCA(小扁豆凝集素)结合型AFP单克隆抗体，使低浓度AFP或小肝癌的阳性检出率由传统方法的33.3％提高到86.7％，假阳性率仅1.2％。因为原发性肝癌以ConA结合型AFP为主，ConA非结合型AFP仅占少数，而继发性肝癌和生殖系统畸胎瘤则正好相反，γ-GTI’，II，II’仅见于肝癌患者，所以伴刀豆球蛋白(ConA)结合型AFP抗体、抗人AFP抗体和抗(γ-GT)I’，II，II’抗体点样即可达到区分它们的目的。当AFP＜400ng/ml，DPC的阳性率达57％，且DPC用于肝癌诊断具有高度的特异性。AFP阴性的肝癌，γ-GTII’的阳性率为84.6％。同样道理，其他多种指标也是按照上述多种指标相互取长补短而设计点样的。如此设计方便医生综合考虑，真正做到一次验血即可确诊。实施例二，如图4胰腺癌诊断芯片所示，A1抗CA19-9抗体A2抗CA242抗体A3抗CA50抗体 B1抗CA72-4抗体B2抗CA125抗体B3抗组织合成肽抗原抗体C1抗癌胚抗原(CEA)抗体C2抗肤脉癌肽抗原(POA)抗体C3抗半乳糖苷转移酶同工酶II(GalTII)抗体D1阳性对照D2阴性对照同上述制作方法，可设计出其他器官的临床检测型恶性肿瘤诊断蛋白芯片。实施例三，普查型恶性肿瘤早期诊断的蛋白芯片，系将两种或两种以上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种恶性肿瘤早期诊断的蛋白芯片，特征在于利用高速全自动点样机器人把多种肿瘤标记物抗体及阳性对照、阴性对照点阵于蛋白芯片的同一腔室内，蛋白质通过化学键连接于固相载体上，所述阳性对照为对应肿瘤标志物，阴性对照为人血清白蛋白。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：张涛，李宾，彭永济，李红梅，任一萍，
申请(专利权)人：上海晶泰生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]