一种去除重组白介素-2内毒素的方法技术

本发明专利技术涉及一种去除重组白介素‑2内毒素的方法，属于生物医药技术领域。本发明专利技术去除重组白介素‑2内毒素的方法包括如下步骤：在pH为7.0～7.5的重组白介素‑2样品Ⅰ中添加阴离子助溶剂十二烷基硫酸钠(SDS)，混匀形成重组白介素‑2样品Ⅱ；在重组白介素‑2样品Ⅱ中加入氯化钠至其浓度为0.8～1.2mol/L，形成重组白介素‑2样品Ⅲ，将所述重组白介素‑2样品Ⅲ通过弱阴离子高效液相色谱柱进行动态吸附；采用平衡液对弱阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，所述平衡液中含有浓度为0.8～1.2mol/L的氯化钠，然后采用洗脱液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的洗脱液，本发明专利技术去除重组白介素‑2内毒素的方法具有内毒素去除效率高、回收率高的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种去除重组白介素-2内毒素的方法
本专利技术属于生物医药
，涉及一种去除重组白介素-2内毒素的方法。
技术介绍
1976年，Morgrn等首次发现在丝裂原刺激的淋巴细胞培养上清或称条件培养基(Conditionalmedium，CM)中存在一种细胞因子，能选择性地维持T淋巴细胞在体外长期生长，人们将该因子称为T细胞生长因子(Tcellgrowthfactor，TCGF)。1979年瑞士召开的第二届国际淋巴因子会议上将联系白细胞间相互作用的因子统称为白细胞介素(Interleukin，IL)，并将由激活的T细胞产生的、在淋巴细胞间起相互作用的因子，即TCGF称为白细胞介素-2(Interleukin-2，IL-2)。IL-2主要由活化的CD4+T细胞和CD8+T细胞(特别是CD4+T细胞)产生，为一种糖蛋白，具有广泛生物活性，能使T细胞在试管内长期存活。随着研究的不断深入，尤其是1983年基因工程(重组)IL-2的问世，使得IL-2的研究取得了更大的进展。人们发现IL-2除了作用于T细胞外，还可作用于多种免疫效应细胞，包括B细胞，巨噬细胞，NK细胞。IL-2可刺激能产生抗体的B细胞增殖并能诱导产生新型的杀伤细胞即淋巴因子激活的杀伤细胞(LAK)，故IL-2成为调控免疫应答的重要因子，具有抗病毒，抗肿瘤及改善和提高机体免疫功能的作用。可提高人体对病毒，细菌，原虫等感染的免疫应答，清除体内肿瘤细胞和病毒感染细胞等。还可以增进抗体和干扰素的分泌，可刺激产生IFN-γ和TNF-α，β；促进Th的增殖和激活；活化中性粒细胞；刺激NK和肿瘤侵润淋巴细胞(TIL)增殖。目前，IL-2已被应用于治疗肿瘤，免疫缺陷和感染性疾病，并取得了显著的效果。但是由于IL-2易被内毒素污染，限制了其治疗应用。内毒素又名脂多糖、类脂A、热源，是革兰氏阴性细菌(GNB)的细胞壁外壁层上的特有结构，其细胞壁外膜的外部脂质成分完全由内毒素分子组成，当细菌死亡时溶解或用人工方法破坏菌细胞后会释放大量内毒素，一个大肠杆菌细胞内约含有200万个LPS分子。内毒素具有化学异源性，不同来源的内毒素相对分子质量变化范围可从几千到几万，且由于内毒素的两亲性使得它在水中能够形成缔合物，其缔合物的相对分子质量可达400000～1000000。内毒素的化学成份主要是脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)。LPS的分子结构非常复杂，而且不同的GNB，它的LPS化学组成也各不相同。LPS的化学结构主要分为两部分：多糖和类脂A(LipidA)。内毒素的主要结构类脂A中含有多个磷酸根结构，因而具有较低的等电点，它的等电点只有3.1。在通常的pH条件下(pH＞3.1)，内毒素带有部分的负电荷。类脂A(LipidA)由氨基葡萄糖、磷酸根、10～18碳的长链脂肪酸组成，它与可溶性的O-侧链及核心分离后即难溶于水。游离后的类脂A可自身凝聚成高分子复合体，其相对分子质量大小不等，同时含有疏水性的中心及亲水性的边沿，是一种双性分子，又是酸碱两性分子，类脂A的独特结构使细菌内毒素具有多种生物活性。内毒素对哺乳类动物有很显著的致热性，少量的内毒素(2ng/kg体重)静脉注射就可以引起发烧，大剂量时可以引起血液循环障碍和内毒素休克。在正常人体内，肝脏在内毒素的清除与解毒过程中起着重要作用，使血液中的内毒素含量保持在较低水平。如果肝功能严重受损，经肠道吸收的内毒素就可通过肝脏进入体内循环，形成内毒素血症，进而加重肝脏损害，并引起肾功能减退等。据文献报道，败血症、尿路感染、脑膜炎、重症肝病、血栓性脉管炎等疾病都可能与内毒素有关。因此国家药典对药品或制剂中的内毒素的含量有严格的规定。内毒素的化学本质说明了从水溶液中将其消除是个难题。内毒素的热稳定性极高，在250℃干热下长达1h才会被分解。内毒素对pH值变化也不敏感，但高浓度的酸或碱可使之失活。内毒素分子由于具有磷酸基团而带负电荷，因此理论上可以用带正电荷的吸附剂来去除，如采用阴离子交换色谱来去除内毒素。然而，实际上这种结合效果不佳。其原因一方面是天然存在的内毒素分子上所携带的磷酸基团(负电荷)已经被阳电荷的离子(Ca2+，Mg2+，Na+，K+等)或多胺(尸胺、精胺、亚精胺、乙醇胺)等中和；另一方面，在自然界中内毒素并不以单一分子存在，而是以相对分子质量不等的集聚体存在，内毒素分子与本身所携带的负电荷参与了聚合体的形成，很少有游离的负电荷暴露在集聚体外表；再者，溶液中往往还存在有其他带负电荷的物质，导致内毒素难以完全分离。因此，在溶液中去除内毒素污染或消除内毒素便成了生物研究中的一个难题。
技术实现思路
本专利技术的目的是针对现有技术存在的上述问题，提出了一种高效去除重组白介素-2内毒素的方法。本专利技术的目的可通过下列技术方案来实现：一种去除重组白介素-2内毒素的方法，所述去除重组白介素-2内毒素的方法包括如下步骤：S1、在重组白介素-2样品Ⅰ中添加阴离子助溶剂十二烷基硫酸钠(SDS)，混匀后调节pH至7.0～7.5，形成重组白介素-2样品Ⅱ；S2、在重组白介素-2样品Ⅱ中加入氯化钠至其浓度为0.8～1.2mol/L，形成重组白介素-2样品Ⅲ，将所述重组白介素-2样品Ⅲ通过弱阴离子高效液相色谱柱进行动态吸附；S3、采用平衡液对弱阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，所述平衡液中含有浓度为0.8～1.2mol/L的氯化钠，然后采用洗脱液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的洗脱液。本专利技术通过采用DEAE阴离子交换填料同时吸附IL-2样品中的IL-2和内毒素，为了提高IL-2的溶解性，在IL-2样品中添加有助溶剂SDS，会附带有SDS，然后采用平衡液洗去SDS，再采用Tris缓冲液解离IL-2，从而将内毒素和IL-2分离开，获得具有低内毒素的IL-2产品。在获得具有低内毒素的IL-2产品后，对色谱柱进行再生处理，从而使得色谱柱可循环使用。IL-2的等电点约为6.5，疏水性强，在中性或偏碱性水性溶液中会聚合沉淀，不易溶解，IL-2浓度越高越容易沉淀。本专利技术在重组白介素-2样品Ⅰ中添加SDS，IL-2分子与SDS充分结合形成带负电荷的IL-2-SDS复合物，复合物所带的负电荷大大超过IL-2分子原有的电荷量，消除了不同IL-2分子之间原有的电荷差异，从而增加了IL-2在弱碱性条件下的溶解性，也增加了IL-2在阴离子填料上的吸附，同时也增加了在含NaCl条件下内毒素在阴离子填料的保留强度。如不添加SDS，本申请的IL-2难以溶解并进行下一步骤。另外，本专利技术上样吸附前在重组白介素-2样品中加入0.8～1.2mol/L氯化钠，氯化钠是离子化合物，带正电荷的钠离子能有效减弱带负电荷的SDS与DEAE阴离子填料表面发生强吸附，避免SDS优先占用吸附面积，导致IL-2吸附量下降，同时避免了因SDS与填料吸附后累积解离后高浓度的SDS随IL-2一同洗脱出来，影响IL-2活性的稳定，同时也避免了SDS在填料的残留增加IL-2在填料的保留强度，从而影响IL-2的回收率。作为优选本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种去除重组白介素-2内毒素的方法，其特征在于，所述去除重组白介素-2内毒素的方法包括如下步骤：/nS1、在重组白介素-2样品Ⅰ中添加阴离子助溶剂十二烷基硫酸钠(SDS)，混匀后调节pH至7.0～7.5，形成重组白介素-2样品Ⅱ；/nS2、在重组白介素-2样品Ⅱ中加入氯化钠至其浓度为0.8～1.2mol/L，形成重组白介素-2样品Ⅲ，将所述重组白介素-2样品Ⅲ通过弱阴离子高效液相色谱柱进行动态吸附；/nS3、采用平衡液对弱阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，所述平衡液中含有浓度为0.8～1.2mol/L的氯化钠，然后采用洗脱液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的洗脱液。/n

【技术特征摘要】
1.一种去除重组白介素-2内毒素的方法，其特征在于，所述去除重组白介素-2内毒素的方法包括如下步骤：
S1、在重组白介素-2样品Ⅰ中添加阴离子助溶剂十二烷基硫酸钠(SDS)，混匀后调节pH至7.0～7.5，形成重组白介素-2样品Ⅱ；
S2、在重组白介素-2样品Ⅱ中加入氯化钠至其浓度为0.8～1.2mol/L，形成重组白介素-2样品Ⅲ，将所述重组白介素-2样品Ⅲ通过弱阴离子高效液相色谱柱进行动态吸附；
S3、采用平衡液对弱阴离子高效液相色谱柱进行第一次洗脱，所述平衡液中含有浓度为0.8～1.2mol/L的氯化钠，然后采用洗脱液进行第二次洗脱，收集第二次洗脱的洗脱液。


2.根据权利要求1所述去除重组白介素-2内毒素的方法，其特征在于，所述去除重组白介素-2内毒素的方法还包括采用大肠杆菌生产重组白介素-2发酵液的预备步骤，以形成重组白介素-2样品Ⅰ。


3.根据权利要求1所述去除重组白介素-2内毒素的方法，其特征在于，步骤S1所述阴离子助溶剂的加入量为重组白介素-2样品Ⅰ的0.03～0.07...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱文瑾，李浛民，陈平，
申请(专利权)人：宁波博睿瀚达生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：浙江;33