本发明专利技术提供了一种柯萨奇病毒Ｂ１－６混合型抗体ＩｇＧ ＥＬＩＳＡ试剂盒。该试剂盒可用于因柯萨奇病毒Ｂ感染致病的早期诊断，检测方法简便快速、成本低廉、灵敏度和特异性高，有较高的临床应用价值。本发明专利技术提供了制备方法。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及生物技术产品，具体涉及一种柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgG ELISA试剂盒及制备方法。柯萨奇病毒B1-6对易感人群具有高度的传染性，儿童是最敏感的人群，病毒流行期儿童的感染率通常为10-20％家庭中所有敏感成员通常都被感染，因此，柯萨奇病毒B感染所致的相关疾病发病率较高，尤其柯萨奇病毒性心肌炎对儿童具有很大威胁和危害。临床的早期诊断和治疗有很重要意义。以往柯萨奇病毒B感染和致病的病原学确诊法是分离病毒，但这种方法的标本采集和处理较复杂，病毒分离程序烦琐，实验时间很长，因此病毒分离技术的早期诊断优势不大。而血清中特异性IgG抗体是继早期特异性IgM抗体出现后又一次病毒感染的主要标志。本专利技术的目的在于克服以往方法的不足之处，研制一种灵敏度和特异性高的诊断试剂盒。本专利技术提供了一种柯萨奇病毒BI-6混合型抗体IgG ELISA试剂盒，该试剂盒是用COXB病毒B1-6混合型抗原包被，羊抗人IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的COXB病毒B1-6混合型抗体IgG，并且由下列试剂组成预包被反应条 48孔酶标记液1瓶(3ml)样品稀释液1瓶(6ml)阳性对照1支(200μl)阴性对照 1支(200μl) 20倍浓洗涤液1瓶(13ml)底物缓冲液甲 1瓶(3ml)底物缓冲液乙1瓶(3ml)终止液1瓶(3ml)本专利技术的另一目的是提供了上述柯萨奇病毒B1-6混合型抗体IgG ELISA试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤一、原材料及其规格COXB病毒B1-6混合抗原1∶1000酶标板华东理工大学 ELISA测定CV(％)＜10％阳性对照诊断心肌炎患者血清，用本试剂盒测定A值＞0.8，放置-20℃备用。阴性对照选正常人血清，用本试剂盒测定A值＜0.09，放置-20℃备用。酶标抗体羊抗人IgG-HRP辣根过氧化物酶，RZ＞3.0Sigma进口酶标记羊抗人IgG，双扩散1∶64。小牛血清 杭州四季清厂生产。其他试剂Na2CO3A.RNaHCO3A.R小牛血清 杭州四季清厂生产Na2HPO4.12H2OA.RNaH2PO4.2H2O A.RNaCL A.RTweel-20 化学纯甘油 化学纯H2O2A.R柠檬酸.H2O A.RTMB 熔点168℃EDTAA.RH2SO4A.RTrisA.R蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定细胞及动物要求(1)Hela细胞(ATCC CCL-2)(2)山羊 雄性 15公斤左右二、包被抗原(COXB病毒B1-6混合抗原)的制备(1)COX B病毒1-6型毒种来源昆明生物所(2)Hela细胞来源中科院细胞所(3)细胞传代①培养剂配制PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培养剂中含牛血清10％青霉素 4万单位链霉素 4万单位6％NaHCO3 4ml3％谷氨酰胺 6ml②胰酶(DT)配制用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化细胞。③细胞传代将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分瓶培养培养3-5天。(4)病毒的感染、培养、收毒和鉴定①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液洗一次。②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时。③补充培养液，在37℃培养。④逐日观察细胞至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒。⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定。病毒滴定用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50ul病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50ul，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50。病毒的鉴定应用免疫电镜法；应用中和试验方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25ul/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25ul/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时。然后每孔内加Hela细胞50ul，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE。(5)抗原的制备、浓缩和纯化①病毒灭活。②去除病毒碎片用冷冻离心的方法去除细胞碎片。③初步浓缩、提纯用PEG方法进行提纯。④病毒的进一步纯化用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的分光光度计进行蛋白含量的测定。三、羊抗人IgG(r)制备(1)人IgG(r)链的制备(2)30ml人脐带混合血清，50％及33％饱和硫酸铵各盐析1次，PH7.2PBS透析去盐，体积浓缩至30％。(3)过Sephadex G200柱，PH8.00.2M Nacl-O.1MTris缓冲液洗脱，分管收集，第二峰为IgG。(4)双扩散法鉴定IgG纯度。(5)10mM疏基乙醇4℃3h解离轻链，对PB透析24h。(6)再过Sephadex G200柱，洗脱液同上，收集第一峰IgG(r)链。(7)双扩散鉴定r链特异性。(8)光密度法测定IgG(r)浓度。(9)抗r链特异性抗体的制备。(10)1mg/ml r链加等量福氏完全佐剂研钵中研磨乳化。(11)每只羊背部多点注射3mg r链抗原，2周-1个月1次，共5-8次，双扩散效价达1∶64以上时采集血清。(12)辛酸法纯化抗血清IgG部分蛋白定量。四、酶标记抗体制备羊抗人IgG(r)用过典酸钠法与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶2000(方阵滴定法测定)五、酶标记羊抗人IgG(r)浓度测定采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶2000六、预包被抗原板的制备(1)包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水 500ml加入适量COXB病毒1-6混合型抗原，调整PH至9.5加入板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干。(2)洗涤Tris 2.42g重蒸水1000ml加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原。(3)封闭蔗糖 100g羊血清 25ml0.1MPBS1000ml加入板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。(4)阳性对照制备诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装。(5)阴性对照的制备正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装。(6)酶标记抗体配制30％小牛血清羊抗人IgG(r)-HRP 50％0.15MPBS(稀释度1∶2000)20％甘油——→稀释20倍分装(7)酶标记抗体稀释液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml调PH至7.2(8)底物液甲Na2HPO4.12H2O 1.7g柠檬酸.H2O 0.5g3％H2O2200ul重蒸水 100ul调PH至5.0(9)底物液乙EDTA 17.5mg柠檬酸.H2O 0.5g重蒸水 100ml加入10mlDMSO含60mg TMB的溶液25ul(10)终止液浓H2SO410ml蒸馏水 80ml(11)20X洗涤液Tris 4.84g重蒸水 100ml七、半成品的检定(1)已本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种柯萨奇病毒Ｂ１－６混合型抗体ＩｇＧ试剂盒，其特征在于该试剂盒是用ＣＯＸＢ病毒Ｂ１－６混合型抗原包被，羊抗人ＩｇＧ联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的ＣＯＸＢ病毒Ｂ１－６混合型抗体ＩｇＧ，并且由下列试剂组成：预包被反应条 ４８孔 酶标记液 １瓶（３ｍｌ）样品稀释液 １瓶（６ｍｌ） 阳性对照 １支（２００μｌ）阴性对照 １支（２００μｌ） ２０倍浓洗涤液１瓶（１３ｍｌ）底物缓冲液甲 １瓶（３ｍｌ） 底物缓冲液乙１瓶（３ｍｌ）终止液 １瓶（３ｍｌ）。
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员：杜凤鸣，
申请(专利权)人：杜凤鸣，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]
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