提取朊病毒蛋白的方法和试剂盒技术

一种用于从生物材料如动物组织或动物产品中提取朊病毒蛋白的方法。在特定的实施例中，用六氟－２－丙醇从匀浆化的绵羊脑组织中提取到异常朊病毒蛋白。通过增加水溶液的离子强度可使六氟－２－丙醇与脑组织水制备物分离开。可将有机提取物中的朊病毒蛋白进一步纯化，或者借助于例如免疫测定法测定此提取物中是否存在朊病毒蛋白，特别是异常朊病毒蛋白。此提取方法使之有可能测定是否存在异常朊病毒蛋白，可用于例如诊断传染性海绵状脑炎（ＴＳＥ）。上面的图显示如通过放射活性（由圆圈表示的）和通过在２８０ｎｍ的吸光度（由曲线图中的实线表示的）检测的↑［１２５］Ｉ－朊病毒蛋白的ＨＩＬＩＣ层析图谱。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

技术介绍
专利技术背景朊病毒病或传染性海绵状脑炎(TSE)引起中枢神经系统渐进的退化性病症而导致死亡(Prusiner，医学研究述评，16487，1996；Weissman，FEBS通讯，2893，1996)。200多年前首次描述了绵羊TSE病，瘙痒病(Pattison，兽医研究，123661，1988)。瘙痒病是这类疾病的原型。对这类疾病还没有已知的治疗方法，也不知道在动物死亡之前如何检测是否存在这种疾病。朊病毒病是由于宿主正常朊病毒蛋白的构象改变成为形成聚集体的异常结构而引起的。因为最近在英国爆发流行牛海绵状脑炎，以及这种TSE与其新的变异形式，一种人TSE病Creutzfeld-Jakob相关联(Bruce等，自然，389498，1997)，所以需要有可灵敏和准确诊断TSEs的新方法。理想地是，这种诊断方法可以在动物显示出临床病征之前，并且在它们进入人类食物链或成为人用药物制品之前用于对动物进行检查。对现有技术的描述用于制备和纯化TSE致病性作用物的方法大多数都包括酶和去污剂处理以及离心处理的复杂程序(Bolten等，病毒学杂志，53596，1985)。异常的朊病毒蛋白质在通常的生物缓冲液中可溶性很差。用于获得纯化异常朊病毒蛋白的一种方法是亲水性相互作用层析法(HILIC)(Plpert，J，层析，499177，1990)，此方法是反相层析法的逆转形式。通常是以70-85％的有机溶剂开始，对逐渐降低的有机梯度液进行层析。按照从最小极性到最大极性的顺序进行洗脱。HILIC的大部分有机移动相与游离在水性溶液中非正常存在的蛋白质是相容的，例如膜蛋白(Jeno等，动物生物化学，215292，1993)，β-淀粉状蛋白肽(1-43) (Alpert等，蛋白质学会第八届讨论会，1994年7月，圣地亚哥，CA)和组蛋白(Lindner等，层析学杂志，A.78255，1997)。表面活性剂和其它的变性剂都是在外水体积或者接近外水体积中被洗脱，而蛋白质和肽一般被良好地保留。通过HILIC纯化之后，可应用毛细管电泳免疫测定法(Schmerr和Jenny，电泳，19409，1998)或者通过毛细管等电聚集法(Schmerr等，层析学杂志，A.802135，1998)检测朊病毒蛋白。如上面所提到的，一般是在动物死亡之后应用这些分析方法检测异常朊病毒蛋白，因此需要在动物死亡前检测异常朊病毒蛋白。此外，还需要一种不借助于超离心步骤分离异常朊病毒蛋白的方法，超离心所需的仪器设备对于兽医诊断实验室是不易获得的。离心要求异常朊病毒蛋白以聚集体的形式存在，它的大尺寸有助于在离心管内形成沉淀。但在随后的步骤中这种聚集体很难被溶解和检测。应用离心法还有可能检测单体的异常朊病毒蛋白，而可能降低任何测定法的灵敏度。现在更加紧迫地需要快速、可靠的野外检测法，例如定性的免疫检测法，以便检测家畜是否感染了TSE。因此，本领域需要有一种简便有效的方法用于提取异常朊病毒蛋白。另外，除了对天然异常朊病毒蛋白产生的抗体之外，其余已产生的抗体是针对单体形式的异常朊病毒蛋白(Korth等，自然，39074，1997)。从而必须用强去污剂或变性剂使异常朊病毒蛋白解聚集，然后在实施大多数免疫检测法之前又必须除去这些变性剂。因此，本领域需要有一种快速简便的方法，提取出与去污剂或变性剂分离的朊病毒蛋白用于免疫测定法分析。本专利技术提供了一种新颖的方法，用于提取所有大小的异常朊病毒蛋白，不论是聚集体形式或单体形式的异常朊病毒蛋白。本专利技术使之有可能应用例如免疫测定法检测来自活动物样品中的异常朊病毒蛋白。例如，可根据血液样品进行诊断，这将便于检测活的动物，有助于从禽群和畜群中除去感染的动物，防止有可能污染消费产品。专利技术概述本专利技术提供了一种方法，用于从怀疑含有异常朊病毒蛋白的生物材料中提取异常朊病毒蛋白。此方法包括在可从生物材料中有效地提取异常朊病毒蛋白进入提取溶剂的条件下，温育提取溶剂与等渗或低渗的生物材料水制备物的混合液。该提取溶剂是异常朊病毒蛋白可溶于其中的一种极性有机溶剂，并且它与低渗或等渗的水溶液是可混溶的，但与感胶离子(Iyotropic)水溶液是不混溶的。可使该混合物的感胶离子活性增加，以致使提取溶剂分离成与生物材料水制备物截然不同的相，从而形成含有来自生物材料的任何异常朊病毒蛋白的提取溶剂。本专利技术还进一步提供了检测动物中是否存在异常朊病毒蛋白的方法，包括对如上所述制备分离的提取溶剂测定其中的异常朊病毒蛋白。还提供了一种试剂盒，用于分离来自生物样品中的异常朊病毒蛋白。此试剂盒包括一种具有上述特征的提取溶剂和一种感胶离子盐或感胶离子盐水溶液，此盐或其水溶液将被加入生物样品的水制备物中，致使该有机溶剂变成与此水制备物不能混溶。在本专利技术的另一实施方案中，该试剂盒包括一种对朊病毒蛋白的检测法，优选地是用于异常朊病毒蛋白的检测法。因此，本专利技术的目标是提供一种从生物样品中分离异常朊病毒蛋白的快速方法。本专利技术还有一个目标是对感染了异常朊病毒蛋白的生物体提供一种早期检测法。本专利技术的进一步目标是提供一种溶剂提取技术，用于从生物样品中分离异常朊病毒蛋白。本专利技术还有另一目标是简化对来自动物或人的生物材料中是否存在异常朊病毒蛋白的分析测定。本专利技术还有一个目标是为进一步测定或纯化提供含有异常朊病毒蛋白的提取物。在本专利技术的附图和详述中将更加详细地呈现本专利技术的这些目标或另一些目标。图2，125I-朊病毒蛋白的HILIC级分的抗体结合。专利技术详述本专利技术提供了一种用于从生物材料中提取异常朊病毒蛋白的方法。借助于免疫测定法可检测此被提取产品中的异常朊病毒蛋白。这种异常朊病毒蛋白的提取方法连同一种免疫测定法，可用于诊断活生物体是否感染了TSE，并且将可用于在全世界检测TSE感染的动物和人。因此，本专利技术促使在缺乏昂贵离心机的临床和兽医实验室有可能进行朊病毒蛋白检测，并进一步使之有可能在野外进行检测。将生物材料的水制备物与提取溶剂合并形成混合物。此提取溶剂是异常朊病毒蛋白可溶于其中的极性有机溶剂，并且此溶剂与非感胶离子等渗水溶剂混溶，但与感胶离子水溶液不可混溶。在特别优选的实施方案中，此提取溶剂是六氟-2-丙醇(也被称为六氟异丙醇或HFIP)。虽然在下面的实施例中提取缓冲液体积和生物材料水制备物的体积是大致相等，但是如在下面所述的，可以使用能形成不同两相的任何比例。在优选的实施方案中，是在大约20℃-100℃的温度范围内温育该混合物。尽管如此，使提取溶剂和生物材料的水制备物都处于同一液相中的任何温度，即冰点与沸点之间的温度都可以使用。在可有效地将来自生物材料中的异常朊病毒蛋白提取进入提取溶剂的条件下温育该提取溶剂-生物材料混合物。温育之后，增加该混合物的感胶离子活性，致使提取溶剂与水制备物分离开。可从生物材料的水制备物中分离出含有朊病毒蛋白的提取溶剂。按照本专利技术，通过加入感胶离子盐可增加提取溶剂-水制备物的感胶离子活性。这种盐可作为固体被直接加入混合物，或者作为浓缩的水溶液被加入。感胶离子盐的优选实例包括硫酸钠和硫酸铵。在下面例证性的特定实施方案中，是通过以大约1∶1的比例(体积/体积)将0.5M硫酸钠加入混合物中来增加其离子强度。因为不需要从尸体解剖检查获得材料所以本专利技术特别方便。按照本专利技术本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于从怀疑含有异常朊病毒蛋白的生物材料中提取异常朊病毒蛋白的方法，此方法包括：（ａ）温育提取溶剂与生物材料的等渗或低渗水制备物的混合液，温育条件是能有效地将生物材料中的异常朊病毒蛋白提取进入此提取溶剂，其中该提取溶剂是：（ｉ）该 异常朊病毒蛋白可溶入其中的极性有机溶剂，并且是（ｉｉ）与非感胶离子水溶液可混溶的，但与感胶离子水溶液不可混溶的，（ｂ）增加此混合液的感胶离子活性，以便使该提取溶剂与生物材料水制备物分离开，得到含有来自该生物材料的任何异常朊病毒蛋白的 提取溶剂。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：安德鲁J阿尔珀特，MJ施梅尔，
申请(专利权)人：美国政府农业部，安德鲁J阿尔珀特，
类型：发明
国别省市：US[美国]