蛋白质的分离和分析制造技术

提供用于蛋白鉴定和／或测序的新方法。这些方法特别适合于筛选抗体文库，在优选实施方案中，利用质谱技术进行直接或间接测序。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及尤其是通过质量分析来分离和分析蛋白质。本专利技术尤其可应用于分离诸如抗体之类的结合蛋白。本专利技术也提供对蛋白质或蛋白质片段的修饰，以便有助于质量分析和或分离由基因文库成员编码的特定蛋白质。关于蛋白质分离，本专利技术提供了借助与特定靶的结合而从这类蛋白质的复杂混合物中分离特定蛋白的新方法。具体地说，本专利技术提供借助于与特定靶抗原的结合而从基因文库衍生的这类抗体结构域混合物中分离特异性抗体结构域的方法。对于蛋白质的分析，本专利技术提供用于分析复杂的蛋白质混合物、尤其是用于比较两种或更多种不同样品之间的蛋白质的新方法。对于借助于与特定靶的结合从复杂混合物中分离蛋白并且在该蛋白的身份或氨基酸序列预先未知的情况下，分离足够的与所述靶结合的蛋白以对该蛋白进行直接表征通常是非常困难的。为了从天然的、合成的或半合成的蛋白的大文库中选择目的蛋白，已经开发了“蛋白展示”法，用该方法产生在物理上与其基因相连接的重组蛋白，使得所述蛋白的回收使得随后可以快速回收所述基因。这类方法包括“体内”展示法诸如在噬菌体(“噬菌体展示”)、细菌和酵母上的展示，还包括“体外”展示法诸如在核糖体上的展示(“核糖体展示”)。可以对所回收的基因进行测序，以便确定所回收蛋白的身份，或可以用所回收的基因再生所述回收的蛋白。如果对基因文库进行蛋白展示法，藉此根据特定特性例如与抗原结合(对于抗体可变区)选择蛋白，那么在每轮选择后，所回收的基因将富集编码显示这类特定特性的蛋白的基因。目前的“体内”展示法的缺点包括对所展示的功能蛋白量的限制(噬菌体展示通常限于小于40kDa的多肽)，通常需要将重组蛋白与宿主蛋白融合(这可能干扰重组蛋白的功能或结合)，以及不能改变每个展示粒子所展示的蛋白数；后者也是“体外”展示法诸如核糖体展示的问题。另外，因为展示粒子的体积小，对于具有特定特性例如与抗原结合的蛋白的选择方法是有限的，使得不容易使用诸如荧光激活细胞分类(FACS)的方法。因此，仍需要发展新方法，以改进从复杂混合物中分离蛋白、特别是改进从复杂的抗体可变区(Fv)混合物中分离Fv。亦即本专利技术提供从复杂混合物中分离蛋白的改进方法。具体地说，本专利技术将由基因文库产生的蛋白文库的应用与质谱法改进、特别是基质辅助激光解附/电离飞行时间(MALDI-ToF)质谱的改进和通过串联质谱(MS-MS)对ToF分离的肽直接测序的能力、最近将ToF和MS/MS结合进一个装置(Q-ToF)的能力以及将HPLC和电喷雾(ES)串联质谱结合的能力相结合。本专利技术也包括从复杂的蛋白混合物中筛选个别蛋白的新方法，用所述方法不用将这些蛋白“展示”，即在所述蛋白与所述靶结合期间或之后将这些蛋白与其相应的基因结合。本专利技术也包括从复杂的蛋白混合物中筛选个体蛋白的新方法，用所述方法所述蛋白以及所述靶均不用“展示”，即与任何其它分子或结构结合。本专利技术也包括从复杂的蛋白混合物中筛选个体蛋白的新方法，用所述方法，所述蛋白及其相应的基因通过加入或包括一个“结合部分(associating moiety)”连接在一起，从而在加入所述“结合部分”或者之前或者之后所述蛋白与所述靶结合。因此，在第一方面，本专利技术提供一种蛋白鉴定、筛选和/或测序的方法，包括提供个别蛋白的文库，所述个别蛋白中的一种或更多种可以与感兴趣的靶结合，其中每种个别蛋白在其序列中包括一个“条形码”序列，该序列可以用来在该文库中鉴定每种个别蛋白。本专利技术的该方面可供用于蛋白、尤其是重组抗体结构域(例如Fv)的文库，从而该文库的各个蛋白成员在其氨基酸序列中包括一段序列(“条形码”)，可以随后对该段序列测序，以便鉴别哪种蛋白与所述特定靶(或在Fv的情况下为“抗原”)结合。该实施方案将尤其可应用于Fv衍生自人类基因的情况，从而所选择的Fv可能适合于人类治疗或诊断用途。在这种特定应用中，由免疫球蛋白cDNA库，例如衍生自人类外周血B细胞的库，或例如用在一个或更多个位置具有半随机化的(“组合”)CDR(互补决定区)的人可变区合成产生的库，产生广泛的Fv基因文库。如果构建该基因文库的方式使得在Fv编码区内或该区的末端包括一个随机(或半随机)基因序列，则这样一种随机/半随机基因序列将产生一种与个别Fv结合的随机/半随机肽序列。采用标准方法诸如寡核苷酸引发/DNA聚合酶延伸或PCR，构建这样一种随机/半随机基因序列，由此用一种随机/半随机合成寡核苷酸序列作为在Fv基因文库构建过程中用来扩增免疫球蛋白基因片段的一对引物之一。如果该Fv文库的成员包括两条链(即重链和轻链衍生链(VH和VL))，而不是单链(通过肽接头连接的VH和VL)，那么可以将各个条形码与每条链连接(或可以仅与其中一条链连接)。当构建该文库时，所得到的Fv各包括一个或更多个“肽条形码”，所述“肽条形码”对于该复杂文库内的特定Fv是特有的，或对于该复杂文库内的一小组Fv是特有的。最好是，所述肽条形码位于单链Fv区的C末端或者VH或VL或者这两者的C末端，并且包括在其本身和Fv区之间邻接的一个或更多个蛋白酶敏感位点，例如肠激酶位点(在Asp-Asp-Asp-Asp-Lys之后切割)、因子Xa位点(在Ile-Glu/Asp-Gly-Arg之后切割)或其它内肽酶位点。如果由合适的基因文库产生这类Fv的混合物，那么将该混合物与靶抗原(或多种抗原，例如细胞上的抗原)混合，其中通常将所述抗原固定化。这导致特异性Fv与靶抗原结合，而非结合物(或弱结合物，取决于洗涤的严格性)被洗去。在洗去多余的抗体后，则通常通过采用用以切割所引入的蛋白酶敏感位点的内切蛋白酶消化，从所述Fv中释放出保留的抗原/Fv复合体。然后将这种释放的条形码标记肽或者直接，或如有需要在借助使得所述肽被捕获到固相的特定氨基酸或氨基酸序列进行捕获后，进行质量分析/质谱测序，所述特定氨基酸或氨基酸序列例如为可以被生物素化用以随后被捕获到固定化抗生物素蛋白或链霉抗生物素蛋白上的半胱氨酸残基。另一方面，可以采用任何其它方法，以测定或者在Fv内或者释放后所述肽条形码的序列，包括用以序列特异性方式与所述条形码结合的特异性配体。在测定得自结合Fv的条形码序列(或部分序列)后，产生相应的合成寡核苷酸，并且用来从该文库中特异性地扩增或富集特定Fv基因。然后这些特定的或被富集的Fv(或VH和VL)基因被进一步用来产生相应的Fv，然后或者单独地，或者作为所分离Fv小库的部分，再测试所述Fv的抗原结合。最后，用该方法，可以产生具有所需抗原结合特性的特定Fv，并且如果所述Fv来自人类来源，则具有潜在的临床用途。该方面也包括应用与个别蛋白或Fv结合的多个条形码，例如在Fv的C末端的两个相邻的条形码，由此通过蛋白酶消化，或者同时从每种Fv释放两种肽，以便增强对与所述靶结合的Fv的识别(identity)，或者顺序释放两种肽，从而在连接多轮消化中使用不同的蛋白酶，以提供一种不同的方式，以随后扩增对应于与该靶结合的Fv的Fv基因。该方面也包括应用同时进行分析的多种条形码，以便增加全部条形码序列的多样性，以提供个别蛋白的特定编码。该方面也包括在个别蛋白内应用条形码，例如在Fv的一个或更多个CDR位置中应用条形码。该方面也包括应用也可能消化所述蛋白靶混合物的蛋白组分的蛋白酶或以及任何本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种蛋白鉴定、筛选和／或测序方法，包括提供一种个别蛋白文库，所述个别蛋白中的一种或更多种可以与目标靶结合，其中每种个别蛋白在其序列中包括一个“条形码”序列，所述序列可以用来在所述文库中鉴定每种个别蛋白。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：FJ卡尔，
申请(专利权)人：拜奥维森有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]