神经酰胺酶基因制造技术

本发明专利技术涉及哺乳类来源的中性／碱性神经酰胺酶，与之特异性结合的抗体，编码该神经酰胺酶的基因，与该基因特异性杂交的探针和引物，该神经酰胺酶的基因工程学制备方法，该神经酰胺酶或基因的检测方法以及细胞内和／或组织内神经酰胺量的调节方法。本发明专利技术可提供可用于神经酰胺结构和功能分析的脂质工程学试剂，及可在与神经酰胺代谢相关的疾病中应用。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及可作为神经酰胺结构和功能分析的脂质工程学试剂应用的、且具有神经酰胺酶活性的多肽，与之特异性结合的抗体，编码该多肽的基因，以及与该基因特异性杂交的探针及引物。本专利技术还涉及上述多肽的基因工程学制备方法，以及该多肽或基因的检测方法及其试剂盒。再者，本专利技术涉及细胞内和/或组织内神经酰胺量的调节方法，该方法有可能应用于因神经酰胺量异常引起的疾病。根据最适pH可把神经酰胺酶分成酸性神经酰胺酶、中性/碱性神经酰胺酶。到目前为止的在酸性区具有最适pH的神经酰胺酶存在于大鼠脑，豚鼠上皮细胞，人肾脏，脾脏，成纤维细胞，上皮细胞等哺乳动物组织，人尿等。另外，已知假单胞菌属的细菌产生神经酰胺酶，这种神经酰胺酶具有的最适pH在碱性区。在这些神经酰胺酶中，已测定了从人尿纯化出的酸性神经酰胺酶的氨基酸序列和编码该神经酰胺酶的基因的碱基序列。而且，利用与上述来源于人尿的酸性神经酰胺酶基因的同源性得到了小鼠的酸性神经酰胺酶基因。但是，目前所报道的来源于哺乳类的神经酰胺酶基因均编码酸性神经酰胺酶，而对于哺乳类中中性/碱性神经酰胺酶的氨基酸序列和基因结构完全不了解，对于高等生物中中性/碱性神经酰胺酶的生物学功能也不清楚。在阐明生物体内神经酰胺的功能、其代谢调控、与神经酰胺相关的疾病的诊断及治疗等研究中，有必要获得与神经酰胺相关的各种酶及与该酶的基因相关的详细信息。但是，如同上述所讲，现状是尚未得到与哺乳类中中性/碱性神经酰胺酶的氨基酸序列和其基因相关的信息。因此，为了开发与神经酰胺相关的上述技术，有必要获得与中性/碱性神经酰胺酶相关、尤其是与其基因相关的信息。如上所述，有几篇报道是关于克隆哺乳类神经酰胺酶基因的，但均是在酸性区显示活性的神经酰胺酶，它们和在中性/碱性区显示活性的神经酰胺酶之间也不可能具有高的同源性。因此，将中性/碱性神经酰胺酶基因作为酸性神经酰胺酶基因碱基序列的同源物来获得是很困难的。本专利技术者们成功地从哺乳类小鼠的肝脏中分离出了中性/碱性神经酰胺酶及其基因。另外，通过杂交和聚合酶链式反应(PCR)等手段，成功地阐明了包括人在内的哺乳类中性/碱性神经酰胺酶的结构。还应用该基因，通过基因工程学方法成功地简便地制备出高纯度的中性/碱性神经酰胺酶，进而完成了本专利技术。也就是说，本专利技术的要点如下。一种基团，它具有从下列核酸构成的组中选择的核酸碱基序列(A)一种核酸，它编码的多肽具有序列表的序列号14中所述的氨基酸序列或其一部分序列，且该多肽具有神经酰胺酶活性；(B)一种核酸，它具有序列表的序列号15中所述的碱基序列或其一部分序列，且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；(C)一种核酸，它编码的多肽具有序列表的序列号14中所述的氨基酸序列中至少1个氨基酸残基发生缺失、添加、插入或置换的氨基酸序列，且该多肽具有神经酰胺酶活性；(D)一种核酸，它具有序列表的序列号15中所述的碱基序列中至少1个碱基发生缺失、添加、插入或置换的碱基序列，且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；以及，(E)一种核酸，它可在严格条件下与上述(A)-(D)任一项所述的核酸的互补链杂交，且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；(F)一种核酸，通过密码子的简并性与上述(A)-(E)任一项所述的核酸具有不同的碱基序列，并且该核酸编码具有神经酰胺酶活性的多肽。重组DNA，它含有上述所述的基因；微生物、动物细胞或植物细胞用的表达载体，它包含上述所述的基因或上述所述的重组DNA；转化体，它携有上述所述的表达载体；具有神经酰胺酶活性的多肽的制备方法，其特征在于，在适于神经酰胺酶基因表达且适于生产该基因编码的多肽的条件下培养上述所述的转化体，从所得培养物中提取具有神经酰胺酶活性的多肽；一种多肽，具有序列表的序列号14中所述的氨基酸序列或其一部分序列，且具有神经酰胺酶活性；一种多肽，它由上述所述的基因编码，且具有神经酰胺酶活性；与上述所述的基因或其一部分互补的反义DNA；与上述所述的基因或其一部分互补的反义RNA；含有上述所述的反义DNA的表达载体；与上述所述的基因或其互补链特异性杂交的寡核苷酸探针或引物；可与上述或所述的多肽特异性结合的抗体或其片断；编码具有神经酰胺酶活性多肽的基因的检测方法，该方法中使用了上述所述的寡核苷酸探针和/或引物；用于检测编码具有神经酰胺酶活性多肽的基因的试剂盒，它含有上述所述的寡核苷酸探针和/或引物；检测具有神经酰胺酶活性的多肽的方法，它使用了上述所述的抗体或其片断；用于检测具有神经酰胺酶活性的多肽的试剂盒，它含有上述所述的抗体或其片断；调节细胞内和/或组织内神经酰胺量的方法，其特征在于，将上述所述的基因或其反义核酸导入细胞和/或组织内，由此来调节细胞内和/或组织内的神经酰胺量。图2是含有神经酰胺酶基因的DNA片断的限制酶谱图。由此得到一惊人的发现，即本专利技术的来源于小鼠肝脏的中性/碱性神经酰胺酶的氨基酸序列与假单胞菌属细菌(绿脓假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa))来源的已知碱性神经酰胺酶的氨基酸序列的同源性低。本专利技术的神经酰胺酶是首次探明的哺乳类来源的中性/碱性神经酰胺酶。因此与众所周知的假单胞菌属细菌来源的已知碱性神经酰胺酶相比，本专利技术的神经酰胺酶对于阐明生物体内神经酰胺的功能、其代谢的调控、及在诊断和治疗与神经酰胺相关的疾病等开发应用方面更有用。以下，说明本专利技术。(1)具有神经酰胺酶活性的多肽本说明书中“具有神经酰胺酶活性的多肽”(本说明书中，有时可能描述为神经酰胺酶)是具有如前所述的、将神经酰胺水解成鞘氨基醇碱和脂肪酸活性的酶。“中性/碱性神经酰胺酶”是指最适pH处于比酸性区域高的区域的神经酰胺酶。作为一个例子，本专利技术中描述了分离纯化出的小鼠肝脏来源的中性/碱性神经酰胺酶的酶化学、物理化学性质。1.作用本专利技术的神经酰胺酶水解神经酰胺生成鞘氨基醇碱和脂肪酸。该神经酰胺酶的活性可按照生物化学杂志，第275卷，第3462-3468页(2000)中所述的方法进行测定。即，将在20μl 25mMTris-HCl缓冲液(pH7.5)中溶解了550pmol的C12-NBD-神经酰胺、1.0％(W/V)胆酸钠及适量酶(神经酰胺酶)的反应混合液在37℃温育30分钟。在沸水浴中将反应液保温5分钟，使反应终止。再将所得反应液减压干燥。将干燥物溶解到氯仿/甲醇＝2/1(V/V)中，用硅胶薄层色谱(展开剂氯仿/甲醇/25％氨水＝90/20/0.5(V/V/V))展开。其后，用CS-9300色谱扫描仪(岛津)，在激发波长475nm、荧光波长525nm处，对上述反应中生成的C12-NBD-脂肪酸进行定量。该酶(神经酰胺酶)的1单位(U)定义为，在上述条件下每1分钟从C12-NBD-神经酰胺水解释放出1μmol C12-NBD-脂肪酸所需的酶量。2.底物特异性脂肪酸部分用14C放射性同位素标记的100pmol各种神经鞘脂置于含5mU本专利技术的神经酰胺酶及1％胆酸钠的25mM Tris-HCl(pH7.5)缓冲液20ml中，37℃作用24小时。用硅胶薄层色谱将反应液展开后，用图像分析仪BAS1000(富士胶卷公司制)检测并定量14C-标记的神经鞘脂与通过酶促反应生成的14C-标记的脂肪酸，并通过所得数值计算出分解率。本专利技术的神经酰胺酶的底物特异性如表1本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种基因，其核酸的碱基序列选自下列核酸构成的组：（Ａ）一种核酸，它编码的多肽具有序列表的序列号１４中所述的氨基酸序列或其一部分序列、且具有神经酰胺酶活性；（Ｂ）一种核酸，它具有序列表的序列号１５中所述的碱基序列或其一部分序列、且编码 具有神经酰胺酶活性的多肽；（Ｃ）一种核酸，它编码的多肽具有序列表的序列号１４所述的氨基酸序列中至少１个氨基酸残基发生缺失、添加、插入或置换的氨基酸序列、且具有神经酰胺酶活性；（Ｄ）一种核酸，它具有序列表的序列号１５所述的碱基序列中至 少１个碱基发生缺失、添加、插入或置换的碱基序列、且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；以及，（Ｅ）一种核酸，它可在严格条件下与上述（Ａ）－（Ｄ）任一项所述的核酸的互补链杂交，且编码具有神经酰胺酶活性的多肽；（Ｆ）一种核酸，通过密码子的简并 性与上述（Ａ）－（Ｅ）任一项所述的核酸具有不同的碱基序列，且编码具有神经酰胺酶活性的多肽。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：伊东信，
申请(专利权)人：宝酒造株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]