一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用，所述解冻液包括：仿生控冰材料0.1‑50g、水溶性糖0‑1.0mol L‑1、缓冲液余量，所述仿生控冰材料为具有亲冰基团和亲水基团的控冰材料；所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团或分子，所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团或分子。本发明专利技术采用具有亲冰和亲水特性的仿生控冰材料制备的解冻液及解冻试剂，能有效控制冰晶生长，显著改善复苏过程中温度变化对于细胞或组织的损害；且生物相容性好，不含动物血清，毒性小，相比于传统含有血清的解冻液，降低了保质期短、带入寄生性生物污染物质等风险，更有利于维持细胞或组织的传代稳定性。且本发明专利技术成分简单，成本低廉，具有良好的应用前景。

【技术实现步骤摘要】
一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用
本专利技术属于生物医用材料
，具体涉及一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用。
技术介绍
冷冻保存是指将生物材料保存于超低温状态下，使细胞新陈代谢和分裂速度减慢或者停止，一旦恢复正常生理温度又能继续发育。该技术自问世以来，成为自然科学领域不可缺少的研究方法之一，已被广泛采用。近年来，随着生活压力的增加，人类生育力呈逐年下降的趋势，生育力保存越来越受到人们的重视，人类生殖细胞(精子、卵母细胞)、性腺组织等的冷冻保存就成为保存生育力的重要手段。另外，随着世界人口老龄化加剧，对捐赠的可用于再生医学和器官移植的人源性细胞、组织或器官的冷冻保存的需求也极速增加。因此，如何高效的冷冻保存珍贵的细胞、组织以及器官资源以备不时之需成为亟待解决的科学技术问题。目前最常用的冷冻保存方法为冷冻。在解冻过程中，需要注意防止冰晶、冷休克、溶质效应、破碎损伤、重结晶、渗透性休克等冷冻融解损伤，基于提高胚胎、卵母细胞复苏存活率的考虑，通常冷冻融解方案为：采用快速复温的方法，将高渗透压的囊胚或卵母细胞置于含有一定浓度梯度的冷冻保护剂的培养液中，从而使得细胞内外的渗透压差距逐渐减小，减缓细胞体积的变化速度，避免解冻过程中造成的胚胎损伤。目前临床广泛使用的大多采用解冻液为含0.33M蔗糖的基础液，稀释液为含0.2M蔗糖的基础液，洗涤液即为基础液的三步法解冻操作。但上述解冻液在复温过程中不能有效的控制冰晶的生长，从而损害细胞。除此之外，目前解冻液因使用成分不明确且易变质的血清，导致解冻液存在保质期短、可带入寄生性生物污染物质等问题。
技术实现思路
为改善现有技术的上述缺陷，本专利技术提供一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用。本专利技术通过以下技术方案实现:一种解冻液，每100mL含有仿生控冰材料0.1-50g、水溶性糖0-1.0molL-1、缓冲液余量，所述仿生控冰材料为具有亲冰基团和亲水基团的控冰材料。根据本专利技术，所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团，例如可与水形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；示例性地，所述亲水基团可以选自羟基(-OH)、氨基(-NH2)、羧酸基(-COOH)、酰胺基(-CONH2)中的至少一种，或，选自例如脯氨酸(L-Pro),精氨酸(L-Arg),赖氨酸(L-Lys)，葡萄糖酸内酯(GDL)，糖类等化合物分子或其分子片段。根据本专利技术，所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团，例如可与冰形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；示例性地，所述亲冰基团可以选自羟基(-OH),氨基(-NH2),苯基(-C6H5)，吡咯烷基(-C4H8N)，或，选自例如谷氨酰胺(L-Gln),苏氨酸(L-Thr),天冬氨酸(L-Asn)，苯环(C6H6)，吡咯烷(C4H9N)等化合物分子或其分子片段。根据本专利技术的，所述仿生控冰材料选自聚乙烯醇(PVA)、氨基酸、多肽、聚氨基酸中的至少一种或两种以上的组合。根据本专利技术的解冻液，所述氨基酸可以选自精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷酰胺酸、天冬氨酸、甘氨酸等中的一种或两种以上的组合；所述短多肽或聚氨基酸为上述氨基酸中的一种或两种以上组成。示例性地，所述多肽为L-Thr-L-Arg(TR),L-Thr-L-Pro(TP),L-Arg-L-Thr(RT),L-Pro-L-Thr(PT)，L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT),L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT),L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT)，L-Thr-L-Cys-L-Thr(TCT)中的一种或两种以上。根据本专利技术，所述仿生控冰材料含量为1.0-50g、2.0-20g、5.0-10g；在一个实施方案中，所述仿生控冰材料含量为3g、4g、5g、10g、25g、30g。作为本专利技术的一个实施方案，所述仿生控冰材料包括PVA1.0-6.0g。作为本专利技术的一个实施方案，所述仿生控冰材料包括氨基酸1.0-40g。示例性地，所述氨基酸为精氨酸与苏氨酸组合而成，例如含有精氨酸1.0-20g、1.0-10g、1.0-5g，含有苏氨酸1.0-10g、1.0-5.0g、1.0-2.5g。作为本专利技术的一个实施方案，所述仿生控冰材料包括聚氨基酸0.1-8.0g，例如1-5.0g。示例性地，所述氨基酸为聚-L-脯氨酸和/或聚-L-精氨酸。作为本专利技术的一个实施方案，所述仿生控冰材料包括多肽1.0-50g；例如1.0-25g、1.0-13g、2.0-10g、1.0-5.0g、。作为本专利技术的一个实施方案，所述仿生控冰材料是PVA与上述氨基酸、多肽、和/或聚氨基酸的组合。根据本专利技术，每100mL冷冻保存液中所述水溶性糖含量为0.1-1.0molL-1，例如0.1-0.8molL-1，0.2-0.6molL-1；具体地，例如0.25molL-1，0.5molL-1，1.0molL-1。一种解冻试剂，包括解冻液I、解冻液II、解冻液III和解冻液IV，所述解冻液I-IV具有如上所述解冻液的组成。根据本专利技术的解冻试剂，所述解冻液II中仿生抗冻材料的含量为解冻液I中的50％-100％，所述解冻液III中仿生抗冻材料的含量为解冻液II中的50％-100％。根据本专利技术的解冻试剂，所述解冻液I-IV中，含有PVA1.0-6.0g；优选地，所述解冻液I-IV中，PVA浓度相同。根据本专利技术的解冻试剂，所述解冻液II中水溶性糖浓度为解冻液I中的50％-100％，所述解冻液III中水溶性糖浓度为解冻液II中的50％-100％，所述解冻液IV中，水溶性糖浓度为0。作为本专利技术解冻试剂的一个实施方案，所述解冻液I以每100mL计，含有氨基酸1.0-50g，PVA1.0-5.0g，水溶性糖1.0molL-1，缓冲液余量；所述解冻液II以每100mL计，含有氨基酸1.0-25g，PVA1.0-5.0g，水溶性糖0.5molL-1，缓冲液余量；所述解冻液III以每100mL计，含有氨基酸1.0-12.5g，PVA1.0-5.0g，水溶性糖0.25molL-1，缓冲液余量；所述解冻液IV以每100mL计，含有氨基酸0-6.25g，PVA1.0-5.0g，缓冲液余量。作为本专利技术解冻试剂的一个实施方案，所述解冻液I以每100mL计，含有PVA1.0-5.0g，水溶性糖1.0molL-1，余量缓冲液；所述解冻液II以每100mL计，含有PVA1.0-5.0g，水溶性糖0.5molL-1，余量缓冲液；所述解冻液III以每100mL计，含有PVA1.0-5.0g，水溶性糖0.25molL-1，余量缓冲液；所述解冻液IV以每100mL计，含有PVA1.0-5.0g，余量缓冲液。作为本专利技术解冻试剂的一个实施方案，所述解冻液I以每100mL计，含有聚氨基酸0.1-9.0g，PVA1.0本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用，其特征在于：每100mL解冻液含有仿生控冰材料0.1-50g、水溶性糖0-1.0mol L-1、缓冲液余量，所述仿生控冰材料为具有亲冰基团和亲水基团的控冰材料；所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团或分子，所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团或分子。/n

【技术特征摘要】
1.一种解冻液在冷冻保存的卵母细胞或胚胎解冻中的应用，其特征在于：每100mL解冻液含有仿生控冰材料0.1-50g、水溶性糖0-1.0molL-1、缓冲液余量，所述仿生控冰材料为具有亲冰基团和亲水基团的控冰材料；所述亲水基团为可与水分子形成非共价作用的官能团或分子，所述亲冰基团为可与冰形成非共价作用的官能团或分子。


2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述亲水基团与水形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；示例性地，所述亲水基团选自羟基(-OH)、氨基(-NH2)、羧酸基(-COOH)、酰胺基中的至少一种，或，选自例如脯氨酸(L-Pro),精氨酸(L-Arg),赖氨酸(L-Lys)，葡萄糖酸内酯(GDL)，糖类等化合物分子或其分子片段；
优选，所述亲冰基团与冰形成氢键、范德华尔斯作用、静电作用、疏水作用或者π-π作用；示例性地，所述亲冰基团选自羟基(-OH),氨基(-NH2),苯基(-C6H5)，吡咯烷基(-C4H8N)，或，选自例如谷氨酰胺(L-Gln),苏氨酸(L-Thr),天冬氨酸(L-Asn)，苯环(C6H6)，吡咯烷(C4H9N)等化合物分子或其分子片段。


3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料选自聚乙烯醇PVA、氨基酸、多肽、聚氨基酸中的至少一种或两种以上的组合；
优选，所述氨基酸选自精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、赖氨酸、组氨酸、谷酰胺酸、天冬氨酸、甘氨酸等中的一种或两种以上的组合；所述短多肽或聚氨基酸为上述氨基酸中的一种或两种以上组成；
优选，所述多肽为L-Thr-L-Arg(TR),L-Thr-L-Pro(TP),L-Arg-L-Thr(RT),L-Pro-L-Thr(PT)，L-Thr-L-Arg-L-Thr(TRT),L-Thr-L-Pro-L-Thr(TPT),L-Ala-L-Ala-L-Thr(AAT)，L-Thr-L-Cys-L-Thr(TCT)中的一种或两种以上；
优选，所述PVA选自等规PVA、间规PVA和无规PVA的一种或两种以上的组合，例如所述PVA的间同规整度为15％-65％，优选间同规整度45％-65％；
优选，所述PVA选自分子量为10-500kDa或者更高分子量的PVA；优选PVA水解度为80％-99％、82-87％、87％-89％、89％-99％、98％-99％。


4.根据权利要求1-3任一项所述的应用，其特征在于，所述仿生控冰材料含量为1.0-40g；
优选，所述仿生控冰材料包括PVA1.0-6.0g；
优选，所述仿生控冰材料包括氨基酸1.0-40g，更优选，所述氨基酸为精氨酸与苏氨酸组合而成；
优选，所述仿生控冰材料包括聚氨基酸0.1-8.0g；
优选，所述仿生控冰材料包括多肽1.0-40g
优选，所述仿生控冰材料是PVA与所述氨基酸、多肽、和/或聚氨基酸的组合。


5.根据权利要求1-4任一项所述的应用，其特征在于，每100mL冷冻保存液中所述水溶性糖含量为0.1-1.0mo...

【专利技术属性】
技术研发人员：严杰，乔杰，闫丽盈，李蓉，王健君，金晟琳，
申请(专利权)人：北京大学第三医院，中国科学院化学研究所，
类型：发明
国别省市：北京;11