自植物萃取物中筛选活性成份的方法及组套技术

本发明专利技术揭示一种自植物的萃取物中筛选出生物活性成份的新颖方法，所述方法包含将植物的粗萃取物的分级成份配置于格状固体载体上，对所述载体加入充作探针的经标记的标的物且适当地培育所述载体，随后检测所预期的信号并回收对应于所述信号的具有生物活性的成份。借助本发明专利技术的新颖方法，可自红花（Ｃａｒｔｈａｍｕｓｔｉｎｃｔｏｒｉｕｓ　Ｌ）的萃取物得到经纯化且具有生物活性的小分子化合物，所述化合物能专一地与血小板膜受体蛋白质ｇｐＩＩｂ／ＩＩＩａ结合。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术有关应用高密度栏格技术以自植物的萃取分级物中筛选出所需的生物活性成份。
技术介绍
植物，特别是草本植物，是对动物具有药理或治疗功效的生物活性成份的天然来源。许多药物或其前驱物是分离获自植物。通常，借助利用惯用的技术(如萃取、沉淀、离心及复杂的层析技术)以自植物或其萃取物中分离经纯化的生物活性成份需耗费大量的人力和时间。迄今，并没有一种简单的方法能快速地自植物或其萃取物中筛选出所需的生物活性成份。近来，高密度栏格技术(high-density gridding technology)已被用于定性或定量地检测于生物样品中是否存有标的物。所述高密度栏格技术是于固体载体已划有栏格的表面上，固定相当多列小体积或微小体积的样品。借助所述高密度栏格技术对可能含有标的物的生物样品是配置或固定于固体载体上，将能与所述标的物杂交或共轭的标记探针加入至所述固体载体上并进一步处理，显影及分析所述经杂交或共轭的固体载体，进而可迅速地筛选出能与所述标记探针进行专一性反应/作用的标的物候选者。然而，迄今借助高密度栏格技术于固体载体上能成功地被检测的标的物仅限于数种大分子标的物，诸如核酸片断/序列或肽或蛋白质。例如，USP 6,004,755揭示一种用于杂交分析的方法，该方法包含于杂交条件下令稳定地载于固体载体表面上的一列探针分子与经终端标记的标的核酸样品接触以产生杂交型态。USP 6,040,138揭示一种使核酸样品杂交至高密度排列的低核苷酸探针类上的方法，其中所述高密度排列的低核苷酸探针类是与所述核酸样品中标的核酸的亚序列互补。USP 6,087,103揭示一种借助配位体结合以筛选标的物的方法，该方法包含利用结合至固体载体上经标记的蛋白质配位体列。先前技术或现有的技术皆未教示或建议借助利用所述高密度栏格技术可成功地筛选出具有生物活性的小分子标的物。因此，有需要发展出一种简单且快速的方法，该方法能大量地自植物或其萃取物中筛选出具生物活性的小分子成份。此外，为符合筛选时技术上的要求，亦有需要发展出一种简单的组套，它能用于自植物或其萃取物中筛选出具有生物活性的小分子成份。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种自植物的萃取物中筛选出生物活性成份的新颖方法，可简单且快速大量地自植物或其萃取物中筛选出具生物活性的小分子成份。本专利技术的方法包含将植物的粗萃取物的分级成份配置于格状固状载体上，对所述载体加入充作探针经标记的标的物且适当地培育所述载体以利于完成特定的作用/反应，及随后检测所预期的信号并回收对应于所述信号具有生物活性成份。本专利技术的一较佳实施例是利用所述新颖的方法以自红花(Carthamustinctorius L)的萃取物中得到能与血小板膜受体蛋白质gpIIb/IIIa进行专一性结合且经纯化的生物活性化合物。为更清楚理解本专利技术的目的、特点和优点，下面将通过结合附图的较佳实施例进一步具体说明本专利技术。附图说明图1A是说明红花(Carthamus tinctorius L)的萃取物于120分钟内的HPLC流洗轮廓图；图1B是说明借助于波长405nm下的吸旋旋光性检测图1A的流洗样品对蛋白质gpIIb/IIIa的结合轮廓图；图2A是说明图1A所示的第25至40分级液所收集的样品组于20分钟内的HPLC流洗轮廓图；图2B是说明借助于波长405nm下的吸旋旋光性检测图2A所示的流洗样品对蛋白质gpIIb/IIIa的结合轮廓图；图3是说明图2A所示的第5和6分级液所收集的样品组于15分钟内的HPLC流洗轮廓图，其中存有单一波峰，其滞留时间为10.7分钟且显示对蛋白质gpIIb/IIIa具有最强的结合活性；图4A是说明经由电喷雾质谱(electrospray mass spetctrum)检测图3的轮廓图所得到的化合物的分子量为268gm/莫耳的曲线图；图4B是说明图3的轮廓图所得到的化合物存有钠盐和寡聚物(2聚物至7聚物)的型式曲线图；图5是说明图3的轮廓图所得到的化合物与蛋白质gpIIb/IIIa的结合曲线，其中当所述化合物的浓度低于10μg/时，所述结合是显著地增加且可达至最大结合量的80％；图6A是说明图3的轮廓图所得到的化合物于抑制血小板聚集上的剂量反应的曲线图，其中当所述化合物的浓度是10至15μg/血液时，最大抑制活性约为85％；图6B是说明当图3的轮廓图所得到的化合物的浓度是17.4μg/时，对血小板聚集的抑制活性与时间的关系曲线图，其中于第14至16分钟的时间间隔中，产生的抑制活性约为最大抑制活性的85％；图7A是说明经由投服图3的轮廓图所得到的化合物(400μg/100μl/鼠)后，活体内抑制鼠的肠系膜静脉的血栓形成与时间的关系。图7B说明静脉内注射图3的轮廓图所得到的化合物于活体内抑制鼠的肠系膜静脉的血栓形成的剂量反应。图7C说明经由口服给予图3的轮廓图所得到的化合物(4mg/鼠)后，活体内抑制鼠的肠系膜静脉的血栓形成与时间的关系图。具体实施例方式本专利技术提供一种自植物的萃取物中迅速地筛选出生物活性成份的方法。所述方法包含分级植物的粗萃取物，令每一个分级液成份配置于固体载体上，将充作探针的标记标的物加入至所述固体载体上，培育所述固体载体以使存在于所述粗萃取物中所需的生物活性成份与所加入的探针进行专一性结合，及随后检测并筛选出所需的生物活性成份。已知植物，特别是草本植物，是从事新药物开发的天然来源。然而，借助惯用的技术以自植物分离得到纯化型式的生物活性成份需耗费大量的人力和时间。高密度栏格技术(high-density gridding technology)已被用于检测样品中所需的标的物，它涉及于固体载体的栏格表面上固定小量体积或微量体积的多列样品。所述高密度栏格技术的优点是在于能同时进行数百个或更多如于个别试管中不同的实验。借助所述高密度栏格技术，将被怀疑含有所需的标的物的样品固定于固体载体上，加入能与所述标的物杂交或共轭的标记探针至所述固体载体上，处理、显影并分析经杂交或共轭的固体载体，且随后可迅速地检测出能与所述标记探针进行专一性反应/作用的标记物候选者。于实际应用上，所述高密度栏格技术已被用于诊断、药物筛选、开发治疗性标的物及决定药理机转等的领域。然而，迄今借助所述高密度栏格技术能成功地检测出的标的物仅限于数种大分子标的物，诸如核酸片段或蛋白质。先前技术或现有的技术皆未教示或建议借助所述高密度栏格技术可成功地检测并筛选出具有所需的生物活性的小分子标的物。本专利技术揭示借助所述高密度栏格技术，可自植物的萃取物中成功地检测并分离出纯化型式的具有生物活性的小分子标的物。依据本专利技术的方法，利用层析法令植物的粗萃取物分级，并令个别的分级物成份固定于具有栏格的固体载体的表面上，随后加入经标记的标的物至所述固体载体上以进行杂交，检测所述固体载体上含有能与所述标记标的物反应/作用的具有生物活性的小分子化合物的位置，且随后回收、分离并最终纯化所述具有生物活性的小分子化合物。于本专利技术的较佳实施例中，起初借助利用HPLC以分级草本植物的萃取物。令个别的分级液配置于具栏格的固体载体的表面上。将经标记的蛋白质加入至所述固体载体的表面上以进行杂交反应。随后除去未结合的蛋白质。筛选出显示与所述标记的蛋白质结合的信号的候选分级液，并重复上本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种自植物萃取物中筛选出生物活性成份的方法，所述方法包含：将植物的粗萃取物分级配置于固体载体上，对所述载体加入能够与所述粗萃取物中所需要的生物活性成份结合的标记标的物，及随后检测并回收所述生物活性成份。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：张素真，徐立伟，
申请(专利权)人：先进基因股份有限公司，
类型：发明
国别省市：71[中国|台湾]