利用免疫玫瑰花结分离细胞的方法技术

本发明专利技术涉及利用免疫玫瑰花结分离细胞的方法。该方法包括使含有具核细胞和红细胞的样品接触一种可使具核细胞与红细胞形成免疫玫瑰花结的抗体组合物。该抗体组合物优选地含有双功能抗体或四聚抗体复合物。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及利用免疫玫瑰花结(immunorosettes)分离细胞的方法。本专利技术包括在本专利技术的方法中使用的新型抗体组合物。纯化的免疫细胞(如T细胞和抗原递呈细胞)群体是研究免疫功能所必需的，并在免疫治疗中使用。对细胞、分子和生物化学过程的研究需要分析分离的某些细胞型。大量技术已经用于分离T细胞亚组、B细胞、嗜碱性粒细胞、NK细胞和树突细胞。造血干细胞的分离也已经是备受关注的领域。纯干细胞群体将促进对血细胞生成的研究，来自外周血和/或骨髓的造血细胞的移植越来越多地与高剂量化学治疗和/或放射治疗结合用于治疗多种疾病，包括恶性、非恶性和遗传疾病。这些移植物中的极少量细胞能长期造血重建，因此有一种强烈需求来发展造血干细胞的纯化技术。此外，严重的并发症和实际上移植方法的成功很大程度上依赖于用于去除移植物中对移植受体造成危险的细胞的方法的效果。这些细胞包括引起异体移植中移植物抗宿主疾病(GVHD)的T淋巴细胞，和可引起恶性生长复发的自体移植物中的肿瘤细胞。通过除去不必要的细胞，从而减少需输入的细胞保藏剂的体积，缩减移植物也是重要的。在某些情况中，从生物样品如骨髓移植物中除去或排除肿瘤细胞是希望的。支气管、乳房导管和胃肠道及泌尿生殖道的上皮癌代表了今天所能见到的主要的实体瘤类型。微转移肿瘤细胞迁移被认为是上皮癌患者的一个重要的预后因素(Braun等人，2000；Vaughan等人，1990)。检测这些转移细胞的能力受组织或液体取样的效率和肿瘤检测方法灵敏度的限制。一种富集血样中循环上皮肿瘤细胞的技术会提高检测转移疾病的能力，并将促进对这些稀少细胞的研究和确定使疾病扩散的生物学变化。造血细胞和免疫细胞已经根据物理性质(如密度)和对可杀伤循环细胞的某些药理试剂的敏感性分离。抗细胞表面抗原的单克隆抗体的出现已经大大扩展了区别和分离不同细胞型的能力。用单克隆抗体从血液和相关细胞悬液中分离细胞群体有两种基本方法。它们的不同之外在于是用抗体区别、标记希望的还是不希望的细胞。在正选择技术中，希望的细胞用抗体标记，并从剩余的未标记/不必要的细胞中移出。在负选择中，标记并移出不需要的细胞。抗体/补体处理和免疫毒素的使用是负选择技术，但是FACS分选和大多数分批免疫吸附技术能适用于正选择和负选择两者。在免疫吸附技术中，细胞用单克隆抗体选择，优先结合到能从剩余细胞中去除的表面上，例如珠柱、烧瓶、磁性颗粒。免疫吸附技术在临床上和研究中受到欢迎，因为它们保持了用单克隆抗体导向细胞的高特异性，但是不同于FACS分选，它们能被放大，以直接处理临床收获物中的大量细胞，它们避免了使用细胞毒性试剂(如免疫毒素)和补体的危险。然而，它们需要利用“装置”或细胞分离表面，如珠柱、淘洗瓶或磁铁。分离造血干细胞、免疫细胞和循环上皮肿瘤细胞的现有技术全都包括一个初始步骤，来除去红细胞，然后是对一种装置或人工颗粒的抗体介导的粘附。(Firat等人，1988；de Wynter等人，1975；Shpall等人，1994；Thomas等人，1994；Miltenyi Biotec Inc.，Gladbach，德国)。在正选择的情况中，还有另外一个步骤从该装置或颗粒中去除细胞。所有这些多个步骤都需要时间并且导致细胞损失。Slaper-Cortenbach等人(1990)描述了一种利用形成免疫玫瑰花结净化骨髓的普通急性白血病(cALL)细胞的方法。该方法需要首先从骨髓样品中去除红细胞，并用可结合cALL细胞的抗体标记。标记的红细胞然后被加回cALL细胞已形成免疫玫瑰花结的样品中。当随后还有一个补体介导的cALL细胞裂解步骤时，该排除方法效果最好。密度分离通常用于将外周血单核细胞与粒细胞和红细胞分离。Ficoll(Amersham Pharmacia Biotech AB，Uppsala，瑞典)是用于此用途的最常用的密度溶液。在Ficoll密度分离中，全血在Ficoll上分层，然后离心。红细胞和粒细胞位于细胞沉淀中，而单核细胞保持在Ficoll血浆界面。该技术的成功依赖于单核细胞和粒细胞密度的不同。如果全血贮存超过24小时，粒细胞密度改变，将与红细胞一起沉淀。在一次密度分离中不能从细胞密度改变的贮存的血液或样品中获得纯单核细胞悬液。由上可见，在本领域中需要提供新型方法，用来从生物样品中分离希望的细胞或去除不希望的细胞。因此，在一个实施方案中，本专利技术提供一种从含有具核细胞和红细胞的样品中分离具核细胞的方法，其包括(1)在具核细胞与红细胞可形成免疫玫瑰花结的条件下，使样品接触一种抗体组合物，后者含有(a)至少一种抗体，其可与将要分离的具核细胞上的抗原结合，该抗体与(b)至少一种可与红细胞结合的抗体直接或间接地连接；和(2)从样品中去除免疫玫瑰花结。该方法能在正选择和负选择方案中使用。该方法适用于含有红细胞的任何样品，包括全血、骨髓、胎肝、脐带血、棕黄层悬液、胸膜和腹膜渗出液和胸腺细胞及脾细胞样品。专利技术详述I.专利技术方法如上所述，本专利技术涉及一种通过细胞与红细胞形成免疫玫瑰花结分离细胞的方法。最广义的来讲，本专利技术提供一种从含有具核细胞和红细胞的样品中分离具核细胞的方法，其包括(1)在具核细胞与红细胞可形成免疫玫瑰花结的条件下，使样品接触一种抗体组合物，后者含有(a)至少一种抗体，其可与将要分离的具核细胞上的抗原结合，该抗体与(b)至少一种可与红细胞结合的抗体直接或间接地连接；和(2)从样品中去除免疫玫瑰花结。该方法能在正选择和负选择方案中使用。在正选择中，希望的细胞形成玫瑰花结。在这种实施方案中，该方法进一步包括裂解免疫玫瑰花结中的红细胞和分离希望的细胞的步骤。因此在正选择方法中，抗体组合物将含有(a)至少一种抗体，其对人们希望获得或从样品中分离的具核细胞特异。优选地，本专利技术的方法在负选择方案中使用。在负选择中，希望的细胞不形成免疫玫瑰花结，而是在去除免疫玫瑰花结后保留在样品中。在负选择方法中，抗体组合物将含有(a)至少一种抗体，其对人们希望从样品中去除的细胞特异。因此，本专利技术提供一种负选择方法，用于在含有希望的细胞、红细胞和不希望的细胞的样品中富集并回收希望的细胞，该方法包括(1)在不希望的细胞与红细胞可形成免疫玫瑰花结的条件下，使样品接触一种抗体组合物，后者含有(a)至少一种抗体，其可与不希望的细胞上的抗原结合，该抗体与(b)至少一种可与红细胞结合的抗体直接或间接地连接；和(2)从剩余样品中分离免疫玫瑰花结，以获得富含希望的细胞的样品。利用多种技术，能将在步骤(1)中红细胞和不需要的细胞之间形成的免疫玫瑰花结与希望的细胞分离。在一个实施方案中，含有疫玫瑰花结的样品在浮力密度溶液(如Ficoll-Hypaque)上分层并离心。免疫玫瑰花结沉淀，而希望的细胞保留在浮力密度溶液与样品之间的界面上。然后从界面上移出希望的细胞供进一步使用。在另外一个实施方案中，在步骤(1)中获得的含有免疫玫瑰花结的样品与一种沉淀试剂(如羟乙基淀粉/明胶或甲基纤维素)混合，并使玫瑰花结沉淀。需要的细胞保留在悬液中，移出用于进一步用途。在另一个实施方案中，在步骤(1)中获得的含有免疫玫瑰花结的样品在借助或不借助离心或反向流动淘析的情况下沉淀。希望的细胞保留在悬液中，移出用于进一步的用途本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种负选择方法，用于从含有希望的细胞、红细胞和不希望的细胞之样品中富集并回收希望的细胞，其包括： （１）在允许不希望的细胞与红细胞可形成免疫玫瑰花结的条件下，使样品接触一种抗体组合物，后者含有：（ａ）至少一种抗体，其可与不希望的细胞上的抗原结合，该抗体与（ｂ）至少一种可与红细胞结合的抗体直接或间接地连接；和 （２）从样品中分离免疫玫瑰花结，获得富含希望的细胞的样品。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：TE托马斯，C皮特斯，P兰斯卓普，
申请(专利权)人：干细胞技术公司，
类型：发明
国别省市：CA[加拿大]