电生理学性质的测定组件及其构照方法技术

本发明专利技术涉及一种用于获得电生理学测量构形的基底及方法，在该测量构形中，一细胞在一测量电极周围形成一高电阻的绝缘带（千兆绝缘带），这使它适于用来测定和监视流经细胞膜的电流。该基底通常是一用来研究细胞膜中电事件的仪器的一部分，例如一用来进行膜片箝术研究生物膜中的离子传输通道的仪器的一部分。该基底具有许多测量位点或测量位点阵列，其带有由晶片加工工艺形成的集成的测量电极和参考电极。该集成的电极通常是银／银卤化物电极，其中的一电极发出离子另一电极接受离子，因而适于在它们之间传导电流。该测量构形中的测量电极和细胞内部之间存在直接的电接触，这允许对该测量构形中的细胞进行快速而有效的测量，因此是一种全细胞测量构形。（*该技术在2020年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种基底及方法，该基底及方法通过建立一种电生理学测量构形(measuring configuration)用来测定和/或监视含离子通道的组织(structure)中的离子通道的电生理学性质，这种含离子通道的组织通常是诸如细胞那样的含有脂质膜的组织；在所述测量构形中，围绕在测量电极周围的细胞膜形成一高电阻的绝缘带(seal)，这使它可以用来测定和监视流经细胞膜的电流。该基底通常是一用来研究细胞膜中的电事件的仪器的一部分，例如是一种通过膜片箝术来研究生物膜中的离子传输通道的仪器的一部分。更具体地说，本专利技术涉及一种用在这类膜片箝位仪器中的基底，这种基底具有高的处理能力并仅需少量的试验化合物、少量的液态载体，并通过同时对大量细胞作独立的平行试验的方法而可在短时间内完成许多试验任务。
技术介绍
Neher、Sakmann、和Steinback在“细胞外的膜片钳位，解析通过生物膜中各个开放通道的电流用的方法”(“The Extracellular PatchClamp，A Method for Resolving Currents Through Individual OpenChannels in Biological Membranes”)，Pflueger Arch.375；219-278，1978中提出了将薄膜的一膜片电绝缘起来并在电压箝位的条件下研究该膜片处的离子通道的总体思想。他们发现，将一含有乙酰胆碱(ACh)的细导管压向肌肉细胞膜表面便可看到电流的离散跳跃，这种电流跳跃是由被ACh所激活的离子通道的开和闭引起的。然而，他们的工作是有限的，因为细导管的玻璃和细胞膜之间的绝缘带的电阻(10到50兆欧)大大地小于离子通道的电阻(10千兆欧)。由该绝缘带所造成的电噪声与其电阻成反比，该绝缘带的电导小于ACh通道的电导，其噪声已经大到足以将流经离子通道的电流掩盖掉。这还破坏细导管内的电压箝位，由于大的电流通过绝缘带而使细导管内的电压不同于浴槽中的电压值。然而发现，只要对玻璃细导管精致地进行抛光并对细导管内部进行抽吸，便可在细胞表面上得到一电阻非常高(1到100千兆欧)的绝缘带。此千兆欧绝缘带使噪声水平降低了一数量级，在这个噪声水平下可以对生物学感兴趣的大多数离子通道进行研究并且大大地拓宽了可以进行研究的电压范围。这种经过改进的绝缘带称作“千兆绝缘带”，而这种细导管称作“膜片导管”。有关千兆绝缘带的更详细的描述可见于O.P.Hamill，A.Marty，E.Neher，B.Sakmann，及F.J.Sigworth的“Imporved patch-clamp techniques for high resolutioncurrent recordings from cells and cell-free membrane patches”，Pflüeger Arch.391，85-100，1981。Neher和Sakmann还由于发展膜片箝术方面的成就而获得1991年度的诺贝尔生理学及医学奖。离子通道是跨膜的蛋白质，这种蛋白质促使无机离子传输跨过细胞膜。离子通道参于许多生理过程诸如形形色色的生成及计时作用电势(generating and timeing action potentials)、突触的传递、激素的分泌、肌肉的收缩等等。许多药物通过调制离子通道来行使其特有的效用。例如，诸如苯妥英及拉莫三嗪之类的抗癫痫化合物对脑中的电压相关Na+通道起阻滞作用，硝苯地平及硫氮酮(Diltiazem)类的抗高血压药物对平滑肌细胞中的电压相关Ca2+通道起阻滞作用，而优降糖和甲糖宁之类的胰岛素释放刺激质则对胰腺中的ATP调节K+通道起阻滞作用。除了化学诱导的离子通道活性调节外，膜片箝术还使科学家能够对电压相关的离子通道进行操纵。这包括调整膜片导管中的电极的极性及改变浴槽溶液中的盐的成分以调节溶液中自由离子的水平。膜片箝术代表了生物学和医学领域中的主要发展，因为该项技术可以测量通过单个离子通道蛋白质的离子流量，还可以研究单个离子通道对药物的响应。简单地说，在标准的膜片箝术中使用了一种很细的(直径约0.5到2微米)玻璃导管，该膜片导管的顶部压在细胞膜表面上，导管的顶部和细胞紧密地保持密封而将很少几个离子通道蛋白质隔离在细胞膜的微小区域内。这些通道的活性可以是单独地进行测量(单通道记录)或交替地测量，还可以将膜片弄破以测量整个细胞膜的通道活性(全细胞记录)。可以用例如向导管内施加负压的方法弄破细胞膜来以高的电导率访问细胞内部以实施全细胞测量。在进行单通道记录和全细胞记录时，可以将一箝位电压跨接在细胞膜的两边来显示单个通道子型(subtypes)的活性。在电压箝位技术中，经过细胞膜的电流是在膜的两边加有恒定的电势的条件下进行测量的。或者更准确地说，放大器要准确地供应一电流，该电流必须使细胞膜维持一由实验确定的电势。因此，由离子通道的开、闭所引起的电流将不会对细胞膜进行再充电。附图说明图1表示现有技术的一标准的电压箝位放大器基本工作原理的简图，这种放大器包括诸如HEKA Elektronik出售的EPC-9放大器。在细导管4内设有一电极6，该电极6与反馈放大器的负端相关联，同时，在放大器的正端(Stim.In.)上接上一箝位电压(相对于接地的浴槽电极8)并通过电压监视器的输出来使其符合要求。由于所测量的细导管电压和箝位电压据推测二者是等同的，细导管电极上将作用一恒定的修正的电势而一电流则被迫通过大反馈电阻。经过转换后，通过电流监视器输出的模拟电压来使电流符合要求。这种实验中的时间分辨率及电压调控是令人印象深刻的，通常是在毫秒或甚至微秒范围内。然而，这种膜片箝术作为一通用方法用来进行药理学筛选遇到一主要障碍是一天中所能试验的化合物的数量有限(通常不超过1或2个)。另外一主要障碍为改变围绕在细胞及膜片周围的溶液的速率非常慢。决定膜片箝术处理能力的主要限制因素是细胞和细导管的定位及箝位，以及供应系统的性能，该系统将溶解了的化合物导引到细胞及膜片上。在常用的膜片箝位装置中，放置在实验腔室中的细胞要连续地灌注一种生理盐溶液。在该腔室中建立细胞和细导管之间的连接是非常费时而困难的工作。化合物放在与一阀门相关联的几个供应瓶中，将仪器的进口连到该阀门上便可施加化合物。所需的运载液体和待试样品的体积是很大的。已经提出了几种高处理能力的膜片箝位测量系统。这些系统通常包括一具有许多位点的基底，该位点适于将细胞固定在测量构形中，该测量构形可以确定细胞膜的电性能。授予Rensselaer的US5,187,096公开了一种用于监视细胞的细胞基质阻抗的仪器。细胞直接培养在电极上然后再覆盖上许多小隔室，这样，就不可能对单个细胞进行测量。授予Leland Stanford的WO 98/54294公开了一种带有井的基底，该井上包含了电极阵列。该带有井及电极(金属电极)的基底是用硅材料以CVD(化学汽相淀积)及蚀刻技术制作的，并且整个电极表面上包含有硅氮化物的钝化层。细胞直接培养在电极阵列上。该基底适于进行电生理学性能测量。该专利还公开了许多测量电路的建议。授予Cenes的WO 99/66329公开了一种基底，该基底的各侧设有电极，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种平面的基底，其具有一第一表面部分及一和第一表面部分相反的第二表面部分，该第一表面部分具有许多位点，其中每个位点都适于固定一含离子通道的组织，并具有一与该位点相关联的测量电极；该基底还带有一或多个参考电极；测量电极及对应的一或多个参考电极当他们通过电解质相互接触并在其间施加一电位差时，通过一种电极发出离子而另一种电极接受离子便会在两种电极之间产生电流；每个所述位点都适于在被固定在该位点的含离子通道的组织和该位点的一表面部分之间提供一高电阻值的绝缘带；该绝缘带提供后，便将下述两个区域隔离开，一个区域由含离子通道的组织的一侧所界定并通过电解质与测量电极接触，另一个区域由含离子通道的组织的另一侧所界定并通过电解质与对应的参考电极电接触，由此可以测定和／或监视流过两种电极之间的含离子通道的组织中的离子通道的电流；该电极通过晶片加工工艺与基底集成在一起。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：约翰W彼德森，皮特泰勒曼，奥利汉森，帕利克里斯托弗逊，摩坦比彻，索伦P奥尔森，乔根杜，拉尔斯托姆逊，
申请(专利权)人：索菲昂生物科学有限公司，
类型：发明
国别省市：DK[丹麦]