库制备制造技术

本公开提供在衔接子接合与PCR扩增之间不需要纯化的DNA库制备方法。将衔接子添加到DNA片段以形成寡核苷酸延伸产物，并且在不停止或中断以进行净化步骤的情况下扩增所述寡核苷酸延伸产物。来自衔接子添加步骤的过量材料(如酶、衔接子或辅因子)不会干扰扩增步骤并且所述扩增步骤的进行不考虑来自接合步骤的试剂的存在。在优选实施例中，所述接合步骤和扩增步骤利用共同引发序列，例如呈衔接子寡核苷酸中的一个的形式。

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】库制备
本专利技术涉及制备用于下一代测序的DNA库。
技术介绍
DNA的下一代测序(NGS)可快速提供大量医学上重要的遗传信息。NGS测序仪器对由临床或生物样品制备的DNA库进行操作。DNA库制备通常使用商业试剂盒，所述商业试剂盒随附用于分离所关注的基因的试剂和说明书。一种常用库制备型试剂盒是由启迪公司(Illumina)(加利福尼亚州圣地亚哥(SanDiego,CA))以商标TRUSEQ出售的库制备型试剂盒。典型库制备试剂盒和方案提供输入DNA的片段化，随后进行末端修复、珠粒净化、A加尾、衔接子接合、珠粒净化、PCR扩增和最终珠粒净化。净化步骤可通过其它已知方法进行，但使用磁珠的净化是流行的，因为使用来自如安津考特(Agencourt)等公司的商业上可获得的试剂盒和说明书相当简单。虽然费时，但珠粒净化被认为是库制备中的必要步骤，因为来自一个步骤的过量试剂如果不被去除，将会干扰或妨碍后续步骤的成功完成。具体来说，应理解，在接合之后需要纯化以去除与后续PCR扩增不相容的衔接子和其它接合反应组分，例如高浓度的镁和PEG。此外，现有方案需要不同的PCR引物以便扩增功能性最终测序库。
技术实现思路
本公开提供不需要在衔接子接合与PCR扩增之间纯化并且其中衔接子寡核苷酸可在扩增期间充当引物的DNA库制备方法。在优选实施例中，将衔接子添加到DNA片段上，并且接着在无中间净化步骤的情况下扩增所述片段。实际上，在一些实施例中，起始衔接子的至少一个寡核苷酸链可以充当扩增引物。在一些实施例中，部分双链衔接子在DNA片段的两端接合到游离5'端上，此后延伸3'端以复制完整衔接子序列。衔接子可为至少部分双链的以通过接合酶促进识别和酶催化。在片段跨越衔接子的主链延伸之后，使衔接子的次要链移位，所得的衔接子接合片段通过聚合酶链反应(PCR)扩增。本公开包括展示在衔接子接合与扩增之间不需要纯化或净化步骤的结果。因此，在扩增期间可能仍存在为衔接子接合而存在的材料，包括如衔接子、酶、辅因子等的材料。衔接子和衔接子添加的其它实施例在本公开的范围内。在某些实施例中，第一衔接子接合到DNA片段上并且第二衔接子与其杂交，之后第二衔接子延伸穿过第一衔接子以形成扩增的寡核苷酸延伸产物。扩增甚至可以使用第二衔接子作为引物。在不停止或中断以进行净化步骤的情况下扩增寡核苷酸延伸产物。来自衔接子接合步骤的过量材料(如酶、衔接子或辅因子)不会干扰扩增步骤并且扩增步骤的进行不考虑来自接合步骤的试剂的存在。实际上，在优选实施例中，接合和扩增步骤利用共同引物，第二衔接子寡核苷酸。本公开的方法适用于单引物富集，其中靶标特异性引物和衔接子用于衔接子接合步骤并且接着还在扩增步骤中用作引物。在此类实施例中，将靶DNA片段化，并且接合索引的正向衔接子。将包含靶探针和反向衔接子的寡核苷酸退火到片段上并且延伸。使所得ds产物变性，并且使PCR引物退火以用于扩增和库富集。所述方法的实施例在PCR步骤之后只需要单一纯化或珠粒净化。本公开的方法与DNA的机械和酶催化剪切两者相容。根据本公开使用的衔接子允许接合和PCR扩增两者，而无需添加不同PCR引物(其需要具有IlluminaY-衔接子)。因此，本公开提供其中消除接合后珠粒净化的库制备方法。根据本公开的方法的库制备可在不超过单一纯化或珠粒净化步骤的情况下进行，并且产生用于测序的高质量库。库制备方法使用也充当PCR引物的测序衔接子。另外，本公开的方法与酶催化和机械DNA片段化两者相容。本专利技术的各方面提供制备测序库的方法。所述方法包括从来自样品的核酸获得多个DNA片段，将所述DNA片段与衔接子寡核苷酸一起培育以形成衔接子接合片段，其中至少第一衔接子寡核苷酸接合到片段上，并且至少第二衔接子寡核苷酸与所述片段杂交并且通过聚合酶延伸，从而形成与靶标互补并且与第一衔接子寡核苷酸互补的序列，并且在衔接子寡核苷酸的存在下扩增DNA片段以形成多个扩增子。在扩增步骤期间，第二衔接子寡核苷酸的拷贝充当引物。在某些实施例中，衔接子接合和扩增包括(a)将第一衔接子附接到每个DNA片段的5′端；(b)使一或多个第二衔接子寡核苷酸退火到DNA片段上，由此一或多个寡核苷酸中的每个包含与存在于片段中的一或多个中的相关序列互补的3′部分，以及包含第二衔接子序列5′部分；(c)用聚合酶延伸所述一或多个第二衔接子寡核苷酸，从而产生一或多个寡核苷酸延伸产物，其中第一衔接子在第一端并且第二衔接子序列在第二端；以及(d)扩增-其中无中间净化或纯化步骤-使用第二衔接子寡核苷酸作为扩增引物的一或多个寡核苷酸延伸产物，以富集在每一端处含有第一衔接子序列和第二衔接子序列的核酸片段。方法任选地包括纯化扩增子以去除过量材料。扩增子可以附接到流动池表面以形成测序簇。方法可以包括对扩增子测序以测定核酸的序列。在一些实施例中，所述方法以逆转录RNA中的任一种开始以获得DNA核酸和/或将来自样品的核酸片段化以获得多个DNA片段。附图说明图1图式一种库制备的方法。图2说明本公开的方法的操作。图3展示所述方法的步骤。图4展示根据所述方法制备的库成员。图5图式用于热循环仪的示例性程序。图6展示接合反应组分对PCR的影响。图7展示实验设置以展示消除接合后珠粒纯化的影响。图8给出实验的结果以展示消除接合后珠粒纯化的影响。图9展示了以下结果：将DNA片段输入到末端修复和接合反应中，接着进行PCR扩增。图10图式Y形衔接子和片段。图11展示通过衔接子接合制备的库的迹线和酶片段化核酸的扩增。具体实施方式本公开涉及用于核酸的下一代测序的简化库制备方法。本公开的方法包括将衔接子添加到DNA片段(例如通过将包括至少部分dsDNA的衔接子的自由端接合到DNA片段的游离5'端，或插入片段)上并且在无中间净化步骤的情况下扩增衔接子(并且任选地通过使用来自衔接子中的一或多个的未接合链作为扩增引物)。在某些实施例中，两个衔接子序列接合到插入片段的5'端上，接着延伸插入片段的3'端以复制衔接子序列。衔接子序列的拷贝变成PCR引物的引发位点，所述PCR引物与衔接子的长链或接合链相同。除了条形码、条形码引发位点和测序器引发位点以外，衔接子的长链还代表簇形成中所使用的序列中的一些或优选全部。衔接子的短寡核苷酸可与3'端接合(并且得到延伸)或不接合(仅用于使DNA接合酶能够与衔接子相互作用，因为接合酶期望dsDNA)。任选地，使用不接合的短寡核苷酸，因此3'延伸在DNA插入片段/片段的3'端起始，与短寡核苷酸的3'端相对。使用高浓度的衔接子确保足够的未接合的寡核苷酸将可用作PCR引物。(如果短寡核苷酸在两端被阻断，那么其无法接合或延伸，这使得库更干净，并且对于PCR中的干扰的关注也更少了。存在衔接子寡核苷酸但不干扰PCR的情境与此类似，但现在衔接子的残余接合寡核苷酸必须用更长寡核苷酸稀释(以提供完整序列)或部分降解以具有比用于PCR步骤的寡核苷酸更低本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种制备测序库的方法，所述方法包含：/n从样品获得多个DNA片段；/n将衔接子接合到所述DNA片段上以形成衔接子接合片段；以及/n在所述衔接子的存在下扩增所述衔接子接合片段以形成多个扩增子。/n

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】20180207 US 62/627,5771.一种制备测序库的方法，所述方法包含：
从样品获得多个DNA片段；
将衔接子接合到所述DNA片段上以形成衔接子接合片段；以及
在所述衔接子的存在下扩增所述衔接子接合片段以形成多个扩增子。


2.根据权利要求1所述的方法，其中接合所述衔接子包括将至少部分双链的寡核苷酸衔接子的第一链接合到所述DNA片段中的一个的5'端上。


3.根据权利要求2所述的方法，其中扩增所述衔接子接合片段包括添加与所述衔接子的所述第一链竞争的扩增引物。


4.根据权利要求2所述的方法，其进一步包含通过聚合酶延伸所述DNA片段的游离3'端以复制所述衔接子的所述第一链。


5.根据权利要求2所述的方法，其中所述衔接子的所述第一链比所述衔接子的第二链长至少几个核苷酸。


6.根据权利要求2所述的方法，其中扩增所述衔接子接合片段包括使用所述衔接子的所述第一链作为扩增引物。


7.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含纯化所述扩增子以去除过量材料。


8.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含将所述扩增子附接到流动池表面以形成测序簇。


9.根据权利要求1所述的方法，其进一步包含将来自所述样品的核酸片段化以获得所述多个D...

【专利技术属性】
技术研发人员：B·李，B·G·施罗德，M·洪，M·彼得森，
申请(专利权)人：纽亘技术公司，
类型：发明
国别省市：美国;US