超长斯托克位移激光诱导荧光双重标记方法及其测定装置制造方法及图纸

一种超长斯托克位移激光诱导荧光双重标记方法，该方法采用超长斯托克位移荧光标记物和普适性纳米金属荧光标记物对生物物质进行双重标记检测。其中超长斯托克位移荧光标记物是以藻蓝蛋白为代表的系列具有超长斯托克荧光位移的荧光标记物；普适性纳米金属荧光标记物是以金为代表纳米范围金属超微颗粒。双重标记采用同一类但不同种标记物进行标记，也可以是采用不同种类标记物进行标记。本发明专利技术的两种标记方法构成了功能和性质上的互补，而且提供了排除干扰的方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及一种荧光标记检测微量生物物质的方法及其测定装置，尤其是一种超长斯托克位移激光诱导荧光双重标记方法及其测定装置。荧光标记是检测微量生物物质的常用方法。理想的荧光标记物(即荧光探针)应该是1、具有较高的荧光发光效率。可以获得较低的检测下限。2、在不同的pH下稳定。可适应不同反应条件下的分析测定。3、标记容易且不影响被标记物的生物活性。可获得较高的标记量。如果标记后损失或破坏生物分子的特异反应位点，势必影响灵敏度和选择性。4、有较好的水溶性。因为绝大多数生物反应是在水溶液中进行。5、在其它物质存在下不易产生荧光淬灭效应。淬灭会大大的降低检测灵敏度。6、产生荧光的激发光波长较长。可避免使用昂贵的紫外激光器。7、有较长的斯托克位移。在较长的斯托克位移情况下，反射、散射的激发光对荧光测量的影响更容易克服。从而提高信/噪比。目前常用的荧光标记物均为荧光染料即小分子有机化合物。虽然大多数荧光标记物具有较高的灵敏度，但都不满足上述中的第4、5、6、7项的要求。特别是第7项要求。通常的荧光标记物的斯托克位移平均在28nm左右。这样就对仪器提出较高的要求，既在激光入射光光路和荧光测量光路设置高质量的窄带干涉滤光片，或在激发光和荧光光路设置高质量的分光系统。这样不但使仪器复杂化，造价昂贵。而且由于滤光片和分光系统大大的削弱了激发光和荧光的强度，使灵敏度大幅度的降低。如欲达到理想的灵敏度就必须要么提高光源的强度，要么提高荧光检测的灵敏度。同样会使仪器复杂，价格昂贵。因此寻找合适的荧光标记物是激光诱导荧光或荧光法测定微量生物物质的关键。藻胆蛋白源于海洋生物红藻(Rhodophyta)，蓝绿藻(Cyanophyta)和隐藻(Cryptophyta)，其生理作用是捕集光能并迅速传递给叶绿素使生物产生光合作用。藻胆蛋白包括藻红蛋白，藻蓝蛋白和别藻蓝蛋白。藻胆蛋白分子量在17-18KD，在其分子结构中含有两条多肽链α和β，每个多肽链均含一个或多个共价连接的发色基团。发色基团是由开链线性延展的四吡咯化合物组成并通过硫醚键连接在载体蛋白的半胱氨酸残基上。藻胆蛋白以(αβ)3三聚体和(αβ)6六聚体立体结构存在。三聚体呈圆盘状，厚度为30直径为120。藻胆蛋白发色基团的能量水平具有不平衡性，因此所有的发色团都是吸收激发光，所以荧光发生在最大激发波长处。在不同的发色团中吸收光能并把能量转移给其他发色团的是供体，而既能吸收激发光能又能发出荧光的是受体。只有受体可以稳定的发出荧光。藻蓝蛋白标记生物分子是属于大分子标记大分子，其标记的机理是利用标记物和被标记物表面所具有的不同的化学官能团之间的化学键合而标记。标记的数量是当被标记分子的分子量和分子体积尺寸与藻蓝蛋白在相同数量级时，每个生物分子标记藻蓝蛋白的数量为N时，此时的N不会大于3。在用金标时，其标记的机理是生物分子表面存在大量的属于化学上软硷的含硫的有机基团，如巯基，硫氢基，二硫键等能与化学上属于软酸的金属如金等强烈结合。在标记数量上，由于金是处于纳米尺度颗粒状态，无论其质量还是其体积都远远小于被标记的生物分子，此时的标记数量可能会很多，通常称为多标记.，N值可以在1到数百。现有的激光诱导荧光检测仪均是采用常规光学的光路构成的即激光光源发出的激光束，经会聚后形成平行光束，在经反射镜反射和聚光镜会聚后照射到孔板被检液表面，产生的荧光经会聚后再经过半反半透镜和准直，会聚等透镜后射入光电倍增管的光阴极上。整个光路系统复杂，并且光损失较大，而且成本较高，操控不方便。本专利技术的目的在于提供一种超长斯托克位移激光诱导荧光双重标记方法，以多种超长斯托克位移荧光标记物和普适性纳米金属荧光标记物对生物物质进行双重标记，可以大幅度提高激光诱导荧光方法的检测灵敏度和分辨能力。本专利技术的再一目的在于提供一种超长斯托克位移激光诱导荧光双重标记方法，它所采用两标记物种标记的方法和标记位点不同，可以分别进行两次标记，这样有助于确认被检测物，并且为有干扰的情况下，提供了排除干扰的基准。本专利技术的又一目的在于提供一种超长斯托克位移激光诱导荧光双重标记测定装置，它省去了大部分会聚镜，准直镜和半反半透镜，不但使光路简洁，而且减少了复杂光路带来的光损失，整体造价较低。本专利技术的目的是这样实现的一种超长斯托克位移激光诱导荧光双重标记方法，该方法采用超长斯托克位移荧光标记物和普适性纳米金属荧光标记物对生物物质进行双重标记检测。所述的超长斯托克位移荧光标记物是以藻蓝蛋白为代表的系列具有超长斯托克荧光位移的荧光标记物；所述的普适性纳米金属荧光标记物是以金为代表的一类金属超微颗粒。而且金属颗粒的大小是在纳米范围，在激光照射下会产生不同波长的反射光和散射光。所述的双重标记采用同一类但不同种标记物进行标记，也可以是采用不同种类标记物进行标记。所述的双重标记方法包括如下步骤1、将由藻蓝蛋白标记好的抗体，再次标记纳米金属标记物；2、测定双抗体由藻蓝蛋白产生的荧光外，测定纳米金属产生的反射光和散射光；3、根据荧光和反射光的强度测定抗体浓度。由藻蓝蛋白标记好的抗体为抗抗体；再次标记纳米金属标记物步骤为胶体金包被方法。一种超长斯托克位移激光诱导荧光双重标记测定装置，它包括激光诱导荧光检测仪器的激光光源、光导纤维束构成的光传输光路、被测物体放置的孔板以及相应的控制电路。采用固体冷光源，该冷光源包括不同波长的半导体激光器和不同波长的高亮度发光二极管。其中所述的光导纤维束为Y型，Y型上部分支的一侧为激发光源的导入端，接激光光源，另一分支侧为测量荧光的导出端，接光电倍增管；Y型下部的汇集端接至孔板位置。Y型上部两侧分支部近汇集端的下端光导纤维束为随机分布。Y型光导纤维束为60根以上。例如，光导纤维束的集合段是用于对样品导入激发光和导出荧光。该光导纤维束有两个分支段和一个集合段，每一个分支段由200根光导纤维构成，两个分支段汇合成一个集合段，该段内的光导纤维是有两个分支段内的光导纤维经无规分布而成。所述的Y型下部的汇集端光导纤维束末尾设有短焦距聚光镜，短焦距聚光镜对应至孔板。所述的Y型上部两侧分支部光路入口和光路出口处分别设有带通干涉滤光片，滤光片前部设有半透—半反透镜。入光光导纤维束和冷光源之间有一个半透—半反透镜，其作用是将两束波长不同的光和为一束光，一同进入导入光导纤维分支段；荧光导出光导纤维段后，设置一个半透—半反透镜，其作用是将不同波长的荧光分为两束。带通干涉滤光片可为一片以上。例如，作为固体冷光源的光路入口，该入口前有一个(或两个)带通干涉滤光片，其带通范围为光源中心波长±5纳米，另外一个分支段是荧光出口，在出口处也有一个带通干涉滤光片，其带通范围为荧光中心波长±5纳米。荧光之后有两套微弱光测量装置，因此测量荧光的导出端所接光电倍增管为高灵敏度，高稳定度和低暗电流型光电倍增管，并且对应两束荧光为两套光电倍增管。所述的控制电路包括一中央控制器CPU，CPU的输入端接经过放大的光电倍增管的输出，CPU的输出接孔板行动控制机构的输入端以及激光光源的触发控制端。所述的孔板行动控制机构由步进电机控制能够沿X、Y轴位移的移动装置构成。根据上述技术方案分析可知，本专利技术具有如下优点首先，依据藻蓝蛋白和纳米金两种标记物的不同标记特征和标记性质，本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种超长斯托克位移激光诱导荧光双重标记方法，其特征在于：该方法采用超长斯托克位移荧光标记物和普适性纳米金属荧光标记物对生物物质进行双重标记。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兆乾，朱果逸，吴志音，
申请(专利权)人：北京天泉方舟科技发展有限责任公司，
类型：发明
国别省市：11[中国|北京]