柯萨奇病毒B抗原酶免试剂盒及制备方法技术

本发明专利技术公开了一种柯萨奇病毒Ｂ１－６混合型抗原试剂盒。该试剂盒用ＣｏｘＢ病毒Ｂ１－６混合型单克隆抗体包被，免抗ＣｏｘＢ１－６病毒抗体ＩｇＧ联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的ＣｏｘＢ病毒Ｂ１－６混合型抗原。本发明专利技术的试剂盒灵敏度和特异性高。本发明专利技术提供了制备方法。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物技术产品，具体涉及一种柯萨奇病毒(Cox)B1-6混合型抗原试剂盒及制备方法。柯萨奇病毒B1-6对易感人群具有高度的传染性，儿童是最敏感的人群，病毒流行期儿童的感染率通常为10-20％家庭中所有敏感成员通常都被感染，因此，柯萨奇病毒B感染所致的相关疾病发病率较高，尤其柯萨奇病毒性心肌炎对儿童具有很大威胁和危害。临床的早期诊断和有效治疗有很重要意义。以往柯萨奇病毒B感染和致病的病原学确诊法是病毒分离和心肌荧光染色，但这两种方法的标本采集和处理较复杂，病毒分离和取心肌荧光染色程序烦琐，实验时间很长，于临床确诊越早其疗效越好。因此病毒分离技术和取心肌荧光法的临床早期诊断优势不大。CoxB1-6病毒符合一般病毒感染后抗原和抗体(IgM、IgG)出现规律。病毒(抗原)血症期，首先在患者血中检测到病毒(抗原)，此期可持续1个月左右。病毒(抗原)出现1-2周后，出现CoxB1-6 IgM(可持续1-2周)，而后大约2周出现CoxB1-6-IgG，因此CoxB1-6混合抗原(CoxB1-6Ag)试剂盒能从血清中直接检测病毒是病毒早早期感染和复制的最主要标志。本专利技术的目的在于克服以往方法的不足之处，研制一种灵敏度高和特异性高的能直接检测出CoxB1-6型病毒感染诊断试剂盒，可以比CoxB1-6IgM和IgG更早的确诊病原。本专利技术提供了一种CoxB1-6-Ag ELISA试剂盒，该试剂盒用CoxB病毒B1-6混合型单克隆抗体包被，兔抗CoxB1-6病毒抗体IgG联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的CoxB病毒B1-6混合型抗原，试剂盒由下列组成预包被反应条48孔/96孔酶标记液 1瓶(3ml)样品稀释液 1瓶(6ml) 阳性对照 1支(200μl)阴性对照1支(200μl) 20倍浓洗涤液 1瓶(13ml)显色剂A 1瓶(3ml) 显色剂B1瓶(3ml)终止液 1瓶(3ml)本专利技术的另一目的是提供了上述柯萨奇病毒B1-6混合型抗原ELISA试剂盒的制备方法，该方法包括下列步骤一、原材料及其规格(一)试剂盒制备用的原料病毒B1-6混合单克隆(Mc)抗体1∶10000阳性对照诊断心肌炎患者血清，用本试剂盒测定A值＞0.8，放置-20℃备用。阴性对照选正常人血清，用本试剂盒测定A值＜0.09，放置-20℃备用。酶标抗体兔抗CoxB1-6病毒IgG-HRP，辣根过氧化物酶，RZ＞3.0Sigma进口酶标记兔抗CoxB1-6病毒IgG，双扩散1∶64。其它试剂Na2CO3A.RNaHCO3A.R小牛血清 杭州四季清厂生产Na2HPO4.12H2O A.RNaH2PO4.2H2O A.RNaCL A.RTweel-20 化学纯甘油 化学纯H2O2A.R柠檬酸.H2O A.RTMB 熔点168℃EDTA A.RH2SO4A.RTris A.R蒸馏水必需符合《中国药典》(1990)之规定细胞及动物要求(1)Hela细胞(ATCC CCL-2)(2)新西兰大白兔 2公斤左右二、包被抗体(CoxB病毒1-6混合单克隆抗体)的制备。(一)CoxB病毒1-6型的制备(1)CoxB病毒1-6型毒种来源昆明生物所(2)Hela细胞来源中科院细胞所(3)细胞传代①培养剂配制PRMI1640基础培养过滤除菌，200ml基础培养剂中含牛血清10％青霉素4万单位链霉素4万单位6％NaHCO34ml3％谷氨酰胺6ml②胰酶(DT)配制用无Ca、Mg离子溶液配制0.3％胰酶消化液，用分散、消化细胞。③细胞传代将成片的细胞倾去培养液，加入DT进行细胞消化，观察细胞已呈疏松网状，既倒去DT，加入营养液后，分瓶培养培养3-5天。(4)病毒的感染、培养、收毒和鉴定①将形态完整、成片的单层细胞倾去培养液后，用不含牛血清的洗液洗一次。②细胞感染病毒后，在37℃吸附1小时。③补充培养液，在37℃培养。④逐日观察细胞至所有细胞产生细胞病变后，用无菌方法收获病毒。⑤微量平底板进行病毒浓度的滴定和病毒鉴定。病毒滴定用10倍的倍比稀释的方法进行病毒的稀释，病毒加入微量板中，每孔加50μl病毒，每个稀释度加4孔，然后加入细胞50μl，设细胞对照，按Reed-Muench方法计算病毒的TCID50；病毒的鉴定应用免疫电镜法及应用中和试验方法(微量滴定法)病毒取100TCID50，加入含抗血清的孔内，25μl/孔，抗血清作1∶4-1∶1024连续4倍稀释，25μl/孔，每个稀释度4孔，将板加盖，37℃中培育2小时。然后每孔内加Hela细胞50μl，同时设病毒阴性、阳性对照，逐日观察细胞病变。是同型的病毒，能被抗血清中和、而不出现CPE；(5)抗原的制备、浓缩和纯化①病毒灭活；②去除病毒碎片用冷冻离心的方法去除细胞碎片；③初步浓缩、提纯用PEG方法进行提纯；④病毒的进一步纯化用葡聚糖过柱、洗脱的方法，然后在A280的分光光度计进行蛋白含量的测定；(二)CoxB病毒1-6型混合单克隆(Mc)抗体的制备(1)CoxB病毒1-6型混合后，免疫Balb/c小鼠；(2)SP2/0骨髓瘤细胞培养准备；(3)细胞融合、筛选、克隆；(4)单克隆鼠抗CoxB1-6型混合抗体IgG鉴定，滴度＞10-6，特异性符合要求。三、兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG的制备用已制备、浓缩和纯化好的CoxB病毒1-6型制备兔抗体IgG(1)CoxB病毒1-6型混合后取1mg/ml加等量完全福氏佐剂钵中研磨乳化。(2)每只兔颈背部多点皮内注射，每两周1次共5-6次。(3)双扩散效价达1∶64以上时采集血清。(4)辛酸法纯化抗血清IgG部分(5)抗血清IgG蛋白定量。四、酶标记抗体制备用过碘酸钠法把兔抗CoxB病毒1-6型混合抗体IgG与辣根过氧化物酶偶联对PBS充分透析，加等体积甘油，-20℃以下保存，效价＞1∶1000(用方阵滴定法测定)。五、兔抗CoxB病毒1-6型抗体IgG浓度测定采用方阵滴定法选择酶标记抗体工作浓度为1∶1000六、预包被抗体板及试剂盒原料的制备(1)包被Na2CO30.6gNa2HCO31.58g重蒸水 500ml加入适量CoxB病毒1-6混合型Mc抗体，调整PH至9.5加入板条各孔中，置湿盒中加盖，4℃过夜后甩干。(2)洗涤Tris 2.42g重蒸水 1000ml加入板条各孔中，静置5秒后甩干，上述操作重复3次，以除去剩余抗原。(3)封闭蔗糖 100g羊血清 25ml0.1MPBS1000ml加入板条各孔中放入湿盒中(加盖)37℃2h，弃去液体，吸水纸上拍干重复一次，待干燥后，放入有干燥剂的塑料袋封口，保存于4℃。(4)阳性对照制备诊断心肌炎患者的血清，60℃放置1小时，除菌过滤，用本试剂盒测定A值＞0.8备用，分装。(5)阴性对照的制备正常人血清用本试剂盒测定A值0-0.09用万分之二硫柳汞防腐备用分装。(6)酶标记抗体配制30％小牛血清兔抗CoxB病毒1-6型IgG-HRP 50％0.15MPBS20％甘油→稀释20倍分装(7)酶标记抗体稀释液小牛血清 30ml0.15MPBS 50ml甘油 20ml20％Tween-20 2.5ml调PH至7.2(8)显色剂ANa2HPO4·12H2O本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种柯萨奇病毒Ｂ１－６混合型抗原ＥＬＩＳＡ试剂盒，其特征在于该试剂盒用ＣｏｘＢ病毒Ｂ１－６混合型单克隆抗体包被，兔抗ＣｏｘＢ１－６病毒抗体ＩｇＧ联接辣根过氧化物酶为检测抗体，检测血清中的ＣｏｘＢ病毒Ｂ１－６混合型抗原，试剂盒由下列组成： 预包被反应条 ４８孔／９６孔 酶标记液 １瓶（３ｍｌ）样品稀释液 １瓶（６ｍｌ） 阳性对照 １支（２００μｌ）阴性对照 １支（２００μｌ） ２０倍浓洗涤液 １瓶（１３ｍｌ）显色剂Ａ １瓶（３ｍｌ） 显色剂Ｂ １瓶（３ｍｌ）终 止液 １瓶（３ｍｌ）。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：杜凤鸣，
申请(专利权)人：杜凤鸣，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]