用于生物学细胞的鉴定和计数的方法及其试剂技术

本发明专利技术涉及鉴定和计数样品中生物学细胞的试剂和方法。这种试剂包含一种选自于至少一种浓度足以使样品中给定类型细胞发生特异性裂解的去垢剂和一种能标记剩余未裂解细胞内核酸的染料。申请优选利用基于流式细胞计数器的自动分析系统来鉴定和计数细胞。（*该技术在2022年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及生物学分析，尤其是血液分析。本专利技术更具体地涉及样品中，特别是对血样中生物学细胞进行鉴定和计数的方法和试剂。生物学样品可以是人或动物的血样，或是其它生物学流体或生物学制剂。在生物学分析领域，人们早就已经意识到在进行诊断时鉴定和精确计数不同细胞群的重要性。实际上，血液正常细胞群中出现平衡比率异常的现象与某些医学状况的出现有关，例如免疫反应，炎症反应等。相似地，异常细胞群的出现也可能与其它状况如白血病的发生有关。传统的细胞学分析方法有许多，包括染色后通过显微镜检查，必要的话经过沉淀或聚合。血液细胞的自动化检测开始于20世纪六十年代对正常白细胞群的分离，参见下列文献(1)Hallerman L.，Thom R.，Gerhartz H.“通过染有吖啶橙的间隔荧光素对粒细胞和淋巴细胞进行电子显微镜差异计数”，VerhDeutsch Ges Inn Med 70217，1964。可以利用各种原理包括细胞的光学和化学特性的流式细胞计数法来分离白细胞。现在已经建立起来几种自动血液学分析方法，其中采用了各种技术，如利用Coulter原理测定体积，通过测量光的衍射来估计尺寸、测量90度光的散射来鉴定细胞的内部结构，及通过荧光素或对不同染料的吸收测定得出细胞之间的亲合力。参见下列参考文献2-5(2)Adams L.R.，Kamensky L.A.，“六种人类白细胞荧光测定法描述”，ActaCytol 18389，1974；(3)Shapiro H.M.等人，“结合血液细胞计数和荧光染色和流式仪器的分类”，J.Histochem Cytochem 24396-411，1976；(4)Terstappen L.W.等人，“多维流式细胞计数红细胞没有裂解的血液中的细胞差异”，血细胞17585-602，1991；(5)Terstappen L.W.，Levin J.，“通过多维流式细胞计数获得骨髓细胞差异数”，血细胞18(2)311-30，1992。科学家们一直对处于细胞周期早期的细胞特征感兴趣，在很长一段时间内，细胞中RNA的含量一直作为周期中一个有代表性的参数，见上述参考文献2-5及下列参考资料6-7(6)Traganos F.，Darzynkiewicz Z.，Sharpless T.，Melamed M.R.，“在一个流式细胞荧光测定系统中采用吖啶橙对不固定细胞中的核糖核酸和脱氧核糖核酸进行同时染色”，组织化学和细胞化学杂志2546，1977；(7)Pollack A.等人，“采用焦宁Y和甲基绿对不同细胞群中RNA的量进行流式细胞计数分析”，细胞计数，Vol.3，no 1，28-35，1982。在法国专利9701090(1997年1月31日)中还公开了用于这种类型分析的一种组合物，和更具体的一种染色剂。为了实现这些技术的自动化操作，必需解决的首要问题是减少处理的次数和制备样品的费用，这可以通过各种途径来解决，其中通过减少通道数使得任何时候只有一个细胞处于研究状态是最显而易见的方法。这种类型的技术先前已由Leon W.Terstappen(见参考文献4)描述过，但是这需要较长的处理和分析时间，尤其在对有核细胞进行精确计数时，因为有核细胞的数量往往比红血球低近一千倍。为了克服该困难，常常把生物学样品分成至少两个等分试验部分，一部分制备成一定的浓度用来研究红血球和血小板，另一部分制备成较高浓度用于研究有核细胞。这些现有技术有着各种缺点。在分析前，这些等分试样部分的处理常包括对红血球的特异性破坏，从而可以方便地测定剩余的细胞。虽然这种方法可以很快地获得测定结果，但这个优点被为了获得理想样品而进行的如反应、转移和染色所耗费的时间给抵消了。试剂溶液中细胞悬液的培养时间与活性成分穿透细胞内部所需时间特别相关。在上文提到的法国专利号9701090中，申请人已经描述加速其穿透的方式，涉及使用添加剂，特别是ionophore类型添加剂以有助于细胞穿透。处理时间是等分试验部分必须经历的连续阶段数的函数。细胞的裂解和染色经常处于两个连续的阶段，以这种或那种顺序(见美国专利6004816)。这两个稀释过程需要耗用更多的物质及较长的最少处理时间。因此本专利技术的一个目的是提供一种能避免上述缺点、用于鉴定和计数生物学细胞的试剂。本专利技术的一个目的是优选提供能使某些细胞尤其是红血球裂解的，能固定有核细胞和同时进行胞内染色的这样一种试剂。本专利技术的目的还提供了使这些操作能在一个便利的短时间内进行的试剂，从而可以最大程度减少费用、分析时间和试剂的使用量。因此本专利技术提供了用于鉴定和计数样品中生物学细胞的试剂，所述试剂包括-一种选自至少一种浓度足以特异性裂解样品中一种给定类型细胞的去垢剂的细胞裂解剂，和-一种可以使剩下没有裂解的细胞内核酸标记的染料。因此本专利技术提供了对生物学样品同时进行裂解和染色的试剂，这样可以通过如一种流式细胞计数系统来分析一个阶段获得的细胞溶液，从而将经过处理的细胞进行分类和计数。因此本专利技术提供的试剂将法国专利FR9701090中描述的一种试剂溶液与一种能使样品中特定类型细胞特异性裂解的细胞裂解剂结合，特定类型细胞优选为红血球。在法国专利FR9701090中描述的染色剂溶液能促进膜的渗透，随后有利于样品中生物学细胞的染色。选择是在红血球裂解前还是裂解后使用这种染色溶液取决于研究的细胞类型。保留染色溶液中试剂原本的作用，并将它掺入在裂解液中，这样可以破坏样品中的红血球，并在计数前将剩余细胞染上色。细胞裂解剂优选包括至少一种具有能使红血球裂解的特定浓度的离子和/或非离子去垢剂。本专利技术采用的去垢剂优选自下列化合物-一级胺，醋酸胺和氯化铵，四铵盐，和三甲乙基溴化铵；-取代二胺的酰胺，二乙醇氨基丙基胺或二乙基氨基丙基酰胺，环二亚乙基三胺的酰胺；-烷基芳基磺酸盐，石油磺酸盐，磺酸甘油酯；-乙醇酰胺，磺基三甲铵乙内酯；-烷基糖苷，皂苷；-聚氧化乙烯醚和脱水山梨醇，聚乙二醇醚。在一个实施方案中，这种去垢剂包括浓度为0.05％(w/v)的Triton X100和浓度为0.0001％(v/v)的吐温20的混合物。说明书中所述的“w/v”指“重量/体积”，“v/v”指“体积/体积”。使用的染料优选为荧光型的。优选的一种染料能特异性地与细胞内核糖核酸结合，一旦它们结合能增强染料的荧光。本专利技术的染料具体可选自下列染料-噻唑橙或1-甲基-4-喹啉P-甲苯磺盐；-噻唑蓝；-4--1-喹啉二碘化物；-3，3’-二甲基氧杂羰花青碘化物或3’-甲基-2-2苯并噁唑碘化物；-硫黄素T；-染料SYTO和TOTO(TM分子探针)；-溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶鎓；-propidium碘化物-吖啶橙；-coriphosphine O；-金胺O；-染料HOECHST 33258和HOECHST 33342；-4’，6-二氨基-2-苯基吲哚二盐酸盐(DAPI)；-4’，6-(二咪唑啉-2-基)-2-苯基吲哚二盐酸盐(DIPI)；-7-氨基放射菌素D；-放射菌素D，和-LDS 751。本专利技术的一个优选实施方案中，试剂还包含至少一种膜渗透剂，这种膜渗透剂能促进染料渗透进标记的细胞。促进膜渗透的试剂是一种有利的负荷质子的离子载体(ionophore)和/本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于鉴定和计数样品特别是血样中的生物学细胞的试剂，其特征在于它包含： － 一种选自于至少一种浓度足以使样品中给定类型细胞发生特异性裂解的去垢剂的细胞裂解剂，和 － 一种能标记剩余未裂解细胞内核酸的染料。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：D勒费尔，S弗里埃克，H查姆普塞克斯，
申请(专利权)人：ABX公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]