非内源的被组成型活化的人G蛋白偶联的受体制造技术

在此公开的是内源人Ｇ蛋白偶联受体（ＧＰＣＲ）的组成型活化的非内源形式，该受体含有（ａ）下列氨基酸区域（从Ｃ－末端到Ｎ－末端走向）和／或（ｂ）横跨ＧＰＣＲ的跨膜－６（ＴＭ６）和细胞内环－３（ＩＣ３）区域的下列核酸序列区域（３’到５’走向），分别是：（ａ）Ｐ↑［１］ＡＡ↓［１５］Ｘ和／或（ｂ）Ｐ↑［密码子］（ＡＡ－密码子）↓［１５］Ｘ↓［密码子］。在最优选的实施例中，Ｐ↑［１］和Ｐ↑［密码子］分别是内源脯氨酸和编码脯氨酸的内源核酸编码区，它位于非内源ＧＰＣＲ的ＴＭ６内；ＡＡ↓［１５］和（ＡＡ－密码子）１５分别是１５个内源氨基酸残基和１５个编码内源氨基酸残基的密码子；Ｘ和Ｘ↓［密码子］分别是非内源赖氨酸和编码赖氨酸的非内源核酸编码区，它位于非内源ＧＰＣＲ的ＩＣ３内。因为最优选包含这些突变的非内源人ＧＰＣＲ被引进哺乳动物细胞并被用作筛选候选化合物，所以包含这些突变的非内源人ＧＰＣＲ在本质上不需要被纯化和分离（即它们被引入到哺乳动物细胞的细胞膜上），尽管如此纯化与分离的非内源的人ＧＰＣＲ是在本公开的范围之内。（*该技术在2019年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
特此声明，本专利技术要求下列在先申请的优先权美国专利申请号09/170,496(1998年10月13日提出申请)、美国专利申请号08/839,449(1997年4月14日提出申请，现在已放弃)、美国专利申请号09/060,188(1998年4月14日提出申请)、美国临时申请号60/090,783(1998年6月26日提出申请)和美国临时申请号60/095,677(1998年8月7日提出申请)。前述的每个申请都以全文引入本申请作参考。本专利技术的领域本专利申请文件所公开的专利技术涉及跨膜受体，具体地讲，涉及被改造的人G蛋白偶联受体(GPCR)，它可被组成型活化。在最优选情况下，被改造的人GPCR可用于筛选药用化合物。本专利技术的背景尽管在人体内有很多种类的受体，但到目前为止最丰富和最与治疗有关的是G蛋白偶联受体(GPCR)。据估计，在人类基因组内有大约100,000个基因，它们中的大约2％即2,000个基因被估计用来编码GPCR。已识别出与其中的约100个GPCR结合的内源配体。由于在发现内源GPCR和发现它的内源配体之间有显著的时间延迟，因此可预测，其余的1900种GPCR将在它们的内源配体被识别之前的很长时间内被识别和鉴定。其实，人类基因组计划正在快速测序人类的100,000个基因，这表明在今后几年内，其余的人GPCR将被完全测序。然而，尽管付出了对人类基因组测序的努力，但仍不清楚科学家如何能够快速、有力和有效率地利用这样的信息来提高和增强人类的健康状态。本专利技术正是指向这个重要目的。包括GPCR在内，其内源配体已被认识的受体被称为“已知”受体，内源配体尚不知晓的受体被称为“孤儿”受体。这种区别并不仅是语义上的，尤其是对GPCR来说。GPCR代表着药物产品开发的一个重要领域60％的处方药物开发自100个已知GPCR中的大约20个。因此，孤儿GPCR将是推进药物工业增长、扩张、增强和发展的机会，就像是金子对于19世纪晚期的加利福尼亚一样。然而，孤儿受体在涉及新药物发现时有一个严重缺陷。这是因为，发现和开发药物的传统途径既需要利用受体又需要利用它的内源配体。因此，迄今为止，孤儿GPCR带给本领域的只是用于发现新药的具有诱惑力且未开发的资源。在探索潜在治疗药物的传统途径下，一般是受体先被识别。在探索药物的努力开始之前，一般会启动精细、费时和昂贵的程序以识别、分离和产生受体的内源配体---对于每个受体，此过程可花费3到10年，成本大约为每个受体500万美元。在探索药物的传统工作可开始之前，必须先消耗这些时间和资金。这是因为，传统的药物探索技术依赖于所谓的“竞争性结合检测”，其中，假定的治疗剂是通过受体被“筛选”的，其目的是找到这样的化合物，它或者能阻止内源配体与受体结合(拮抗剂)、或者能促进或模仿与受体结合的配体的作用(激活剂)。其总体目标是要识别出这样的化合物，它们在配体与受体结合时能阻止细胞活化(拮抗剂)，或者当配体与受体适当地结合时能促进或增强细胞活性(激活剂)。由定义可知，孤儿GPCR的内源配体尚未被识别，因此不可能应用传统药物发现技术去发现针对这些受体的独特的新治疗药物。正如下面将揭示的，本专利技术能够克服传统药物发现技术所导致的这些和其他严格限制。GPCR都具有一个相同的基元(motif)。所有这些受体具有七个由22到24个疏水氨基酸组成的序列，它们组成七个α螺旋，每个α螺旋都跨过膜(每个跨度都以数字表示，例如，跨膜-1(TM-1)、跨膜-2(TM-2)等)。跨膜螺旋通过氨基酸链连接，在细胞膜的外部即“细胞外”一边的氨基酸链分别在跨膜-2和跨膜-3、跨膜-4和跨膜-5、跨膜育一小时。接着加入麦胚凝集素小珠(25μl，Amersham)，组合物在室温下再温育30分钟，然后试管在1500×g、室温下离心5分钟，并在闪烁计数器上记数。另一个花费更少但同样可适用的方法已被识别，它也可满足大规模筛选的需要。Flash platesTM和WallacTM闪烁带可被用来格式化高处理量的GTPγS结合测定。进一步，利用此技术，本方法可用于已知的GPCR，它在通过GTPγS的结合监测化合物效应的同时，同时监测与受体结合的由氚标记的配体。这之所以可能的是因为Wallacβ计数器可以把能量窗口切换成监测氚和35S标记的探针。本方法也可用于侦查导致受体活化的其他类型的膜活化事件。例如，本方法可用于监测许多受体的32P磷酸化(针对G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体)。当膜被离心到孔的底部时，结合的GTPγS或32P磷酸化的受体将要活化包被在孔上的闪烁剂。Scinti_带(Wallac)已被用来展示这个原理。另外，本方法也可通过应用放射标记的配体用来测量与受体结合的配体。以相似的方式，当放射标记的结合的配体被离心到孔底时，闪烁带标记在位于标记的配体附近，这导致活化并被检测到。基于前述的程序，比较空白对照(pCMV)、内源APJ和非内源APJ的代表性结果被图示于图6。2.腺苷酸环化酶设计用来进行基于细胞的测定的Flash PlateTM腺苷酸环化酶试剂盒(New England Nuclear；目录号SMP004A)被改进以应用于未加工的胞浆膜。闪烁板的孔含有闪烁剂包被层，其中含有识别cAMP的特异抗体。在孔中产生的cAMP通过直接和放射性cAMP示踪物竞争与cAMP抗体结合而被定量。下面是对测量在表达受体的膜上cAMP水平变化程序的简短描述。在转染后大约3天收获转染细胞。通过在含有20mM pH 7.4的育一小时。接着加入麦胚凝集素小珠(25μl，Amersham)，组合物在室温下再温育30分钟，然后试管在1500×g、室温下离心5分钟，并在闪烁计数器上记数。另一个花费更少但同样可适用的方法已被识别，它也可满足大规模筛选的需要。Flash platesTM和WallacTM闪烁带可被用来格式化高处理量的GTPγS结合测定。进一步，利用此技术，本方法可用于已知的GPCR，它在通过GTPγS的结合监测化合物效应的同时，同时监测与受体结合的由氚标记的配体。这之所以可能的是因为Wallacβ计数器可以把能量窗口切换成监测氚和35S标记的探针。本方法也可用于侦查导致受体活化的其他类型的膜活化事件。例如，本方法可用于监测许多受体的32P磷酸化(针对G蛋白偶联受体和酪氨酸激酶受体)。当膜被离心到孔的底部时，结合的GTPγS或32P磷酸化的受体将要活化包被在孔上的闪烁剂。Scinti_带(Wallac)已被用来展示这个原理。另外，本方法也可通过应用放射标记的配体用来测量与受体结合的配体。以相似的方式，当放射标记的结合的配体被离心到孔底时，闪烁带标记在位于标记的配体附近，这导致活化并被检测到。基于前述的程序，比较空白对照(pCMV)、内源APJ和非内源APJ的代表性结果被图示于图6。2.腺苷酸环化酶设计用来进行基于细胞的测定的Flash PlateTM腺苷酸环化酶试剂盒(New England Nuclear；目录号SMP004A)被改进以应用于未加工的胞浆膜。闪烁板的孔含有闪烁剂包被层，其中含有识别cAMP的特异抗体。在孔中产生的cAMP通过直接和放射性cAMP示踪物竞争与cAMP抗体结合而被定量。下面是对测量在表达受体的膜上cAMP水平变化程序的本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种内源的人孤儿Ｇ蛋白偶联受体（ＧＰＣＲ）的组成型活化的非内源形式，该受体含有下列氨基酸残基（从Ｃ－末端到Ｎ－末端走向），它们横跨非内源的ＧＰＣＲ的跨膜－６（ＴＭ６）和细胞内环－３（ＩＣ３）区域：Ｐ↑［１］ＡＡ↓［１５］Ｘ其中： （１）Ｐ↑［１］是位于非内源ＧＰＣＲ的ＴＭ６区域内的一个氨基酸残基，其中，Ｐ↑［１］选自（ｉ）内源的孤儿ＧＰＣＲ脯氨酸残基和（ｉｉ）除脯氨酸之外的非内源的氨基酸残基；（２）ＡＡ↓［１５］是１５个氨基酸残基，它们选自（ａ）内源的孤儿ＧＰＣ Ｒ的１５个内源氨基酸残基、（ｂ）１５个非内源的氨基酸残基和（ｃ）１５个组合的氨基酸残基，其中含有内源孤儿ＧＰＣＲ的至少一个内源氨基酸残基和至少一个非内源氨基酸残基的组合，除非在位于ＧＰＣＲ的ＴＭ６区域内的１５个内源氨基酸残基都不是脯氨酸；和（３）Ｘ是位于所说的非内源ＧＰＣＲ的ＩＣ３区域内的非内源氨基酸残基。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：多米尼克P比汉，德里克T查默斯，廖王蓁，
申请(专利权)人：阿瑞那制药公司，
类型：发明
国别省市：US[美国]