人肿瘤抗原P185 的制备和检测方法技术

本发明专利技术可溶性ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］抗原的双抗体夹心ＥＬＩＳＡ检测方法，特征在于将经纯化的、用表面表位包埋法制备的ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］单克隆抗体作包被抗体结合于固相支持物上，分别将含有可溶性ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］的样品和纯化的已知浓度的ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］标准抗原与包被的抗体温育，再用另一种经纯化的、辣根过氧化物酶标记的、用表面表位包埋法制备的ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］单克隆抗体做检测抗体的夹心ＥＬＩＳＡ检测方法。所述纯化的ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］标准抗原是采用表面表位包埋法制备的抗ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］胞外区的单克隆抗体与Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ－ＰｒｏｔｅｉｎＧ共价交联的亲和珠对含有ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］抗原的样品进行亲和层析的方法得到的；本发明专利技术检测方法具有检测可溶性ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］抗原的特异性强、标准可溶性抗原的纯度高的优点；可用于肿瘤血清诊断。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及肿瘤抗原的制备、可溶性肿瘤标记物的免疫学检测技术及其在肿瘤诊断中的应用。
技术介绍
p185HER-2是由癌基因neu/erbB-2/HER-2编码的一种重要的肿瘤细胞表面跨膜糖蛋白，在乳腺、卵巢、肺、胃、肝等十余种癌症中均显示有过量表达的p185HER-2蛋白。据美国《科学》杂志(Science，1989，244707-712)报导，约有30％以上的乳腺癌和卵巢癌病人肿瘤组织的细胞出现p185HER-2高表达，该类病人肿瘤恶性程度高、预后差。《英国癌症杂志》(Br J Cancer，1994，70，739-742)报导，检测p185HER-2对多种肿瘤的鉴别诊断、判断预后以至治疗均有重要意义。尤其对乳腺癌，p185HER-2已被国际公认为一个重要的临床指标。《中国免疫学杂志》(2000，16；539-541)报导，通过细胞表面表位包埋法研制的p185HER-2单抗能特异性地与高表达p185HER-2的细胞膜外区结合，对高表达p185HER-2肿瘤组织具有很强的膜定位性和低胞浆染色，特别适合对临床病例组织中p185HER-2进行免疫组织化学方法检测。虽然免疫组化方法是目前较为常规的检测方法，但该方法必须在外科手术切除病患组织的前提下才能使用，而且不便于检测大批样品以及对术后病人的长期跟踪，而病人手术前后p185HER-2的表达水平对预后和指导治疗方案具有非常重要的作用。血清p185HER-2检测技术可对病人进行动态观察又简便易行，更适合临床需要。美国《生物化学杂志》(JBiol Chem，1990；2661716-20.)报导，应用抗体在转基因的高表达p185HER-2的细胞株培养上清中可以检测到可溶性p185HER-2即p105水平；并指出p185HER-2与其他细胞膜受体分子类似，在过量表达时其胞外区可自细胞表面脱落而进入血清。随后荷兰《乳腺癌研究和治疗》杂志(Breast cancer Res treat 1993；2497-102)和美国《癌症》杂志(Oncology1997；54475-481)等先后报导了利用抗p185HER-2抗体并采用酶联免疫吸附(ELISA)技术进行血清p185HER-2检测。《美国临床病理杂志》(Am J ClinPathol，1999112(suppl.1)S53-S67)综述了世界上16个实验室有关血清p185HER-2的研究结果，指出血清p185抗原水平升高与肿瘤复发或转移具有很强的相关性，并且预示着对化疗、放疗及激素治疗的抗性，因此血清p185HER-2抗原可以作为一个重要的肿瘤标记物供临床使用。现有制备p185HER-2抗原的方法主要有A法如美国《临床分析杂志》(Journal ofClinical Analysis，12298-303，1998)报导的用Superose 12 HR层析方法从含有p185HER-2蛋白的细胞裂解液中纯化p185HER-2蛋白，这种方法是根据蛋白的分子量进行分离纯化，没有特异性，因此p185HER-2抗原容易丢失，纯化效率低；B法美国《癌症研究》(Cancer Research，51，2593-2598，May15，1991)报导的用凝集素亲合柱从含有p185HER-2蛋白的细胞裂解液中亲合层析p185HER-2蛋白，这种方法使用的亲和柱对所有的糖蛋白包括p185HER-2蛋白都有吸附作用，因此特异性低，所得抗原的纯度低；C法，如美国《癌症研究》(CancerResearch，51，2593-2598，May15，1991)报导的用活化的Sepharose 4B亲和柱从含有p185HER-2胞外区蛋白的细胞培养上清中亲和层析p185HER-2蛋白，这种方法中使用的亲和柱需要先标记上抗体，但是抗体在Sepharose 4B亲和珠上定位的多样性使得抗体上结合抗原的位点没有充分地暴露于亲和珠之外，又由于p185HER-2的分子量较大，因此造成了一定的空间位阻，p185HER-2抗原不能充分地与亲和柱上的抗体结合，层析效率低；D法，如美国《免疫学方法杂志》(Journal of Immunological Methods，132，1990，73-80)报导的先对含有p185HER-2胞外区蛋白的细胞培养上清进行亲合层析，再进行离子交换层析，这种方法中增加了离子交换层析，离子交换层析是根据蛋白等电点的不同进行纯化，没有特异性，因此不仅步骤烦琐，而且增加了抗原损失的机会。现有检测人血清p185HER-2的方法主要有A法，如荷兰《乳腺癌研究及治疗》(Breastcancer research and treatment，4387-95，1997)杂志报导的均相磁微粒法。这种检测方法将抗体标记的磁微粒作为固相载体，操作要求较高，检测抗体需要标记上acridiniumeaster，检测时将acridinium easter激活，产生的信号是荧光信号，需要用特殊的荧光检测仪，费用较高，尚不易于推广。B法，如美国《肿瘤研究》(cancer research 51，2593-2598，May 15，1991)报导的放射免疫测定法这种检测方法需要将检测抗体标记上同位素，产生的信号是γ射线，需要用γ计数仪检测，操作时需要特殊的防护。C法，如美国《临床化学》(Clinical Chemistry 45，No2，1999，292-295)报导的凝集素—酶联免疫方法(lectin-ELISA方法)，这种方法用凝集素代替抗体作为检测试剂，特异性低。D法，如美国《抗癌研究》(Anticancer research 182891-2894，1998)报导的三抗体夹心酶联免疫检测方法(三抗体夹心ELISA法)，这种方法步骤较为繁琐，不仅需要制备抗p185HER-2的单抗，还要制备抗p185HER-2的多抗，多抗的特异性不够强，批次间的稳定性不易于保持。E法，如美国《临床癌症杂志》(Journal of Clinical Oncology，Vol 10，N0 9(September)，1992，1436-1443)报导的双抗体夹心酶联免疫方法(双抗体夹心ELISA法)。这种方法采用ELISA酶标板作为固相基质，操作简单；反应的信号是酶底物反应后的颜色变化，人体不需要接触放射性同位素，安全；采用双抗体夹心法特异性强，永生细胞产生的单克隆抗体的稳定性易于保持。但现有的E法由于其使用的标准抗原与A、B、C、D方法一样，通常是采用凝集素亲和柱亲合层析方法、离子交换层析方法、Superose 12 HR层析方法或者Sepharose 4B亲合层析方法获得的，特异性不够强，抗原的纯度低。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种标准可溶性p185HER-2抗原的制备方法、可溶性p185HER-2抗原的双抗体夹心ELISA检测方法以及该检测方法在肿瘤血清诊断中的用途。本专利技术的标准可溶性p185HER-2抗原的制备方法，包括制备与抗体交联的亲和珠、制备含有p185HER-2抗原的样品、将含有p185HER-2抗原的样品与亲合珠混合、将混合物装柱和洗脱抗原；其特征在于所述与抗体交联的亲和珠是采用表面表位包埋法制备的抗p185HER-2胞外区的单克隆抗体与Sepharo本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种标准可溶性ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］抗原的制备方法，包括制备与抗体交联的亲和珠、制备含有ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］抗原的样品、将含有ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］抗原的样品与亲合珠混合、将混合物装柱和洗脱抗原；其特征在于：所述与抗体交联的亲和珠是采用表面表位包埋法制备的抗ｐ１８５↑［ＨＥＲ－２］胞外区的单克隆抗体与Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ ４Ｂ－ＰｒｏｔｅｉｎＧ共价交联的亲和珠。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：刘兢，李平，吴强，姚阳，官伟宁，杨峰，
申请(专利权)人：中国科学技术大学，
类型：发明
国别省市：34[中国|安徽]