肺炎衣原体检测用抗体制造技术

本发明专利技术提供能够特异、而且高灵敏度迅速地检测属于肺炎衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）的微生物的方法，该检测中使用的检测用抗体、检测用试剂盒、以及检测中使用的抗体的制造方法。作为抗属于肺炎衣原体的微生物的核糖体蛋白质的抗体是可特异与该微生物反应的抗体。使用该抗体检测样品中的该微生物的方法以及含有该抗体的检测用试剂盒。该抗体的制造方法。作为核糖体蛋白质有核糖体蛋白Ｌ７／Ｌ１２蛋白质，用于肺炎病原微生物的感染检测。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及到作为一般的肺炎病原微生物属于肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)的微生物检测中有用的抗体、该微生物的检测方法、该微生物的检测用试剂盒、以及该微生物检测用抗体的制造方法。本专利技术在医疗上，特别是在由肺炎衣原体引起的非典型肺炎的诊断中很重要。本专利技术在诸如从咽喉棉签、组织样品等检测样品以及体液采集的检测样品中含有的微生物肺炎衣原体的检测中很有用。感染症病原菌的检测一般分为经过病原菌的分离培养、根据其生理学上、生物化学上或结构上的特性对其进行鉴定的培养鉴定法；通过聚合酶链式反应(PCR)或特异的核酸杂交使病原菌的基因扩增，对该基因进行检测的基因诊断法以及利用抗体和病原菌的抗原标记物的特异反应检测病原菌的免疫学方法。然而使用培养鉴定法或基因诊断法时，要获得结果花费的时间长。因此利用能够在短时间内、高灵敏度地对病原菌进行检测，迅速地与相应患者的治疗联系起来的免疫学方法的诊断被广泛采用。以往在利用免疫学方法检测感染症病原菌时，使用因菌种各异的标记抗原和抗体的组合。肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)在世界上是肺炎的一般病原菌。是小的、非运动性的革兰氏阴性菌，有选择地侵入人体内，引起疾病。成为病原巢的动物还不清楚。血清阳性率在30～40岁成年人中为40～50％(Hyman，Roblin等1995)。该微生物可引起咽喉炎、支气管炎和轻度肺炎。该细菌是非常微小的专性寄生生物，在宿主细胞的细胞质中生长。在组织培养液中肺炎衣原体的生长非常缓慢(Godzik，O’Brien等1995)，在培养液中鉴定到细菌至少需要3～5日(Essig，Zucs等1997)。因此迅速检测病原菌的诊断方法不能使用革兰氏染色法和培养法等。因此作为衣原体的迅速诊断法往往使用利用抗体的免疫学方法。当为衣原体(Chlamydia)属时，已知存在作为属特异抗原的脂多糖(LPS)的抗原决定族(Verkooye，Van Lent等1998)，特别是在各种各样的诊断用试剂盒中砂眼衣原体(Chlamydia trachomatis)的检测用试剂抗体正被利用。另外Peterson等人(Peterson，Cheng等1993；Peterson，de la Maza等1998)和Batteiger等人(Batteiger，Newhall等1986)报道了抗Chlamydia属的主要外膜蛋白质(MOMP)单克隆抗体。虽然还不清楚这些抗体在区别肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)和沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)中的作用，但后来知道这些抗体在阐明肺炎衣原体种内的多个抗原性的差别时起着重要的作用。这样的抗原只在肺炎衣原体种内的血清类型分类中起作用，但在需要检测肺炎衣原体种的所有菌株的通常诊断中并不起作用。尽管具有普遍功能的共同抗原及其大部分结构在微生物种间被保存下来，但为了区别它们可用于检测的抗原到目前为止还不清楚。本专利技术涉及到以同一功能的分子普遍存在于所有微生物的，且在制备抗体中用作蛋白质抗原的蛋白质。通常这样的小分子只伴有小规模的结构变化。对这样的具有同一功能普遍存在的分子的大规模结构变化可能会对生物的生存产生重大的坏影响。商业上可利用的检测衣原体病原体的单克隆抗体只有很少几个，远未达到充分程度。直到最近，只有TWAR株被认为是肺炎病原菌(Thom和Grayston 1991；美国专利No.5,008,186)。最近报道了几种衣原体病原体的血清型。LPS或MOMP因菌株而异，现状是用抗一种血清型的抗体不能覆盖全部血清型。本专利技术人发现了在所有微生物中保持同一功能的蛋白质可作为有用的抗原。通常人们预想这样的蛋白质结构变化非常小。然而令人吃惊的是抗该蛋白质抗体是微生物种或属特异性抗体，抗该蛋白质抗体在用于微生物种或属特异性识别中可能具有多样性，同时发现作为检测对象的微生物其所有血清型都可以检测。本专利技术人着眼于以具有同一功能的分子存在于所有微生物细胞的，而且其氨基酸结构具有微生物间一定程度差异的细胞内分子、特别是核糖体蛋白-核糖体蛋白L7/L12。已知核糖体蛋白L7/L12是分子量约为13kDa的蛋白质，是蛋白质合成所必需的核糖体蛋白质。特别是在包括肺炎衣原体在内的几种微生物中的核糖体蛋白L7/L12的全部氨基酸序列已被解析。本专利技术人注意到除了该分子在微生物间类似之外，还注意到其中一部分具有各个微生物固有的结构部分，发现通过利用抗该肺炎衣原体的核糖体蛋白L7/L12蛋白质的抗体有可能对各种各样的微生物、细菌种特异的、且所有同一菌种内血清型进行检测。本专利技术人通过得到抗肺炎衣原体的该蛋白的特异抗体，发现利用该抗体可以对肺炎衣原体进行特异检测，完成了本专利技术。本专利技术发现并开发了抗肺炎衣原体核糖体蛋白L7/L12蛋白质的特异单克隆抗体。该抗体是新的抗体，与以往众所周知的任一抗体都不同，具有与上述蛋白质进行特异反应的性质。序列表中序列1和2分别是肺炎衣原体的核糖体蛋白L7/L12基因的DNA序列(NCBI数据库查询码#NC#000922)和对应的氨基酸序列(NCBI数据库查询码#AE001593.1，NCBI数据库)。序列表记载的氨基酸序列的左端和右端分别是氨基末端(以下称为N端)和羧基端(以下称为C端)，而碱基序列的的左端和右端分别是5’端和3’端。序列比对测试的氨基酸序列用氨基酸单字母缩写表示。而序列比对测试中「+」标记表示有差别的氨基酸，但疏水性等性质类似的氨基酸，「」中的空白表示包括性质在内都不相同的氨基酸。而本专利技术叙述的基因操作的一系列分子生物学实验根据通常实验书记载的方法进行。上述通常实验书如《分子克隆实验手册》Molecular Cloning，A laboratory manual，Cold Spring HarberLaboratory Press，Sambrook，J.等人(1989)。表1序列比对测试Ct1 MTTESLETLVEQLSGLTVLELSQLKKLLEEKWDVTAAAPVVAVAGAAAAGDAPASAEPTE 60+TTESLETLVE+LS LTVLELSQLKKLLEEKWDVTA+APVVAVA A G+AP +AEPTECp1 VTTESLETLVEKLSNLTVLELSQLKKLLEEKWDVTASAPVVAVA-AGGGGEAPVAAEPTE 59Ct61 FAVILEDVPSDKKIGVLKVVREVTGLALKEAKEMTEGLPKTVKEKTSKSDAEDTVKKLQE 120FAV LEDVP+DKKIGVLKVVREVTGLALKEAKEMTEGLPKTVKEKTSKSDAEDTVKKLQ+Cp60 FAVTLEDVPADKKIGVLKVVREVTGLALKEAKEMTEGLPKTVKEKTSKSDAEDTVKKLQD 119Ct121 AGAKAVAKGL 130AGAKA KGLCp120 AGAKASFKGL 129Ct沙眼衣原体Chlamydia trachobatisCp肺炎衣原体Chlamydia pneumoniae本专利技术中所谓“微生物”指的是肺炎衣原体(Chlamydia pneum本文档来自技高网...

【技术保护点】
抗属于肺炎衣原体（Ｃｈｌａｍｙｄｉａ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）微生物的核糖体蛋白质的抗体，是对该微生物特异反应的抗体。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：M拉曼，江藤高志，
申请(专利权)人：旭化成株式会社，
类型：发明
国别省市：JP[日本]