用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒及其制备方法技术

本发明专利技术涉及一种用于同时检测四种致畸胎疾病（ＴｏＲＣＨ）的试剂盒及其制备方法。该试剂盒由免疫渗滤金标法联检反应装置、缓冲液和胶体金标记物混合液组成，其中在免疫渗滤金标法联检反应装置中的硝酸纤维素膜上，点制有ＨＣＭＶ基因工程抗原、ＨＳＶ基因工程抗原、ＲＶ基因工程抗原和ＴＯＸ基因工程抗原四种蛋白和质控物羊抗鼠ＩｇＭ抗体。本发明专利技术还公开了该检测试剂盒的制备方法。本发明专利技术的试剂盒利用胶体金免疫渗滤方法的原理，在同一载体上实现了四种致畸胎疾病的同时检测，操作简便、迅速、准确。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及生物
，具体涉及一种。ToRCH是四种人类致病微生物英文名称字头的组合包括巨细胞病毒(HCMV)、单纯疱疹病毒(HSV)、风疹病毒(RV)和弓形虫(TOX)。它们是四种最可能导致畸胎的传染病的病原体，孕妇如患有这四种传染病中的一种，就能引起胎儿畸形，因此，对这四种病原体的检查已成为孕妇身体检查的必检项目。巨细胞病毒属疱疹病毒群，此病毒普遍存在于人体中，其传染源是患者和无症状的隐性感染者。从怀孕早期到后期，孕妇都可以被此病毒感染。受感染后，临床症状不明显，或有轻微类似上呼吸道感染症状，如发烧不适、皮疹、淋巴结肿大等。一般来说，早期感染易引起流产、死胎，后期感染主要引起小头畸形、智力发育障碍，亦有报道可引起先天性心脏病、脐疝、足畸形和肝脾肿大等。单纯疱疹是由单纯疱疹病毒所致的传染性疾病。人类HSV系DNA类病毒，根据其原性质的不同分为两型即HSV-I和HSV-II。人是单纯病毒唯一的自然宿主，病毒经过口腔、呼吸道、生殖器以及皮肤破损处侵入体内，潜居于人体粘膜、血液、唾液、神经组织及多数器官内。若孕妇感染单纯疱疹，妊娠早期可引起死胎、流产、小头畸形、小眼畸形、脑内钙化等神经系统畸形，其症状与巨细胞病毒相似。风疹病毒是传染性最强的致畸因子，亦是致畸作用最明显的一种病毒。孕妇被风疹病毒感染后可有风疹症状或症状比较轻微，因此往往易被忽略。感染越早，胎儿发生畸形率越高、越严重。风疹病毒诱发先天性畸形除白内障外，还有心脏畸形(动脉导管未闭、心房和心室间隔缺损)、耳聋、青光眼、小眼、小头、智能发育不全和牙釉质缺损等。最近发现风疹病毒还可以引起胎儿生长迟缓，心肌损害。患风疹发生先天性畸形可达40％以上。弓形虫是专一性的细胞内寄生虫，它破坏人体除红细胞以外的所有有核细胞。弓形虫主要寄生在人的大脑，其次是眼睛和心脏，以致病态与寄生态交替出现，对人类的威胁极大。孕妇感染弓形虫，还可通过胎盘感染胎儿，造成早产、死产或胎儿畸形或其它先天性疾病，尤其是造成智力低下，带来严重后果。在我国，每年出生100多万与弓形虫感染有关的畸形儿和先天性残疾儿。由此可见，要求孕妇做以上四种病原体的检测，对于优生优育具有重大意义。目前，对于ToRCH的诊断，大都采用酶联免疫吸附法(ELISA)或免疫荧光法(IFA)进行。该方法涉及的试剂较多，操作复杂，反应时间长。胶体金免疫渗滤方法是在酶联免疫吸附分析方法(ELISA)的基础上发展起来的一项技术，它以微孔滤膜为载体，利用微孔滤膜的可滤过性和毛细管作用，使抗原与抗体的反应、洗涤在一个特殊的渗滤装置上，以液体渗滤过膜的方式迅速完成。由于此方法简单、快速、除试剂外不需任何仪器设备，几分钟即可用肉眼观察结果，目前已在临床检测中取得了广泛的应用。胶体金免疫渗滤方法可应用于免疫学检测的几乎所有方面，但主要用于检测正常体液中不存在的物质(如病原体的抗体)，以及正常含量极低而特殊情况下异常升高的物质(如β-hCG)。近年来由于试剂原料的精选和制备技术的改进，应用范围更加广阔。但目前很少有人将胶体金免疫渗滤技术用于多种疾病相关抗原和抗体的同时检测。本专利技术公开的用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒由免疫渗滤金标法联检反应装置、缓冲液、胶体金标记液组成，其中在免疫渗滤金标法联检反应装置中的硝酸纤维素膜上，相距一定距离分别点有HCMV基因工程抗原，HSV基因工程抗原，RV基因工程抗原，TOX基因工程抗原和质控物羊抗鼠IgM抗体，抗原的点样体积为0.3-3μ1。本专利技术所述胶体金标记液是鼠抗人IgM单抗的金标记物溶液，鼠抗人IgM单抗被胶体金标记的蛋白浓度为80-120μg/ml，其中所用的胶体金颗粒大小为20-60nm。本专利技术所述的缓冲液为含有体积浓度为0.01-0.07％Tween20的0.01-0.05M，PH7.2-8.8的PBS(由磷酸二氢钾或磷酸二氢钠和磷酸氢二钠配制而成的缓冲液)缓冲液。本专利技术所述的HSV基因工程抗原可以是HSV-I型的抗原、HSV-II型的抗原或HSV-I型抗原和HSV-II型抗原的混合物。本专利技术所要解决的另一技术问题是提供上述检测试剂盒的制备方法。本专利技术公开的用于同时检测四种致畸胎疾病的试剂盒的制备方法包括下列步骤一、制备免疫渗滤金标法联检反应装置1.膜上加样物的制备将HCMV基因工程抗原置于0.01M-0.05M，pH7.2-8.8的PBS溶液中，4℃透析过夜。透析后的HCMV基因工程抗原用pH7.2-8.8的PBS溶液稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。将HSV基因工程抗原置于0.01M-0.05M，pH7.2-8.8的PBS溶液中，4℃透析过夜。透析后的HSV基因工程抗原用pH7.2-8.8的PBS溶液稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。将RV基因工程抗原置于0.01M-0.05M，pH7.2-8.8的PBS溶液中，4℃透析过夜。透析后的RV基因工程抗原用pH7.2-8.8的PBS溶液稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。将TOX基因工程抗原置于0.01M-0.05M，pH7.2-8.8的PBS溶液中，4℃透析过夜。透析后的TOX基因工程抗原用pH7.2-8.8的PBS溶液稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。将羊抗鼠IgM抗体置于0.01M-0.05M，PH7.2-8.8的PBS溶液中，4℃透析过夜。透析后的羊抗鼠IgM抗体用0.01M-0.05M，pH7.2-8.8的PBS溶液稀释至0.2-2.0mg/ml，4℃保存备用。2.在膜上加样分别吸取上述HCMV基因工程抗原、HSV基因工程抗原、RV基因工程抗原、TOX基因工程抗原，仔细地点于硝酸纤维素膜的特定位点上，点样体积为0.3-3μl/点。另吸取羊抗鼠IgM抗体，于同一硝酸纤维素膜上远离上述各点样位置的地方作一标记，此标记可为一点、一条线或其他符号。3.膜的后处理将上述硝酸纤维素膜置37℃烘箱内30分钟。取出后室温放置20分钟以上。然后将其浸没于37℃的封闭液中20分钟。取出后，在室温下置于洗涤液中振荡洗涤5-10分钟。更换洗涤液，重复上述振荡洗涤过程。取出后，室温下晾干。4℃干燥环境中保存备用。其中所述的封闭液为含有体积浓度为0.01-0.07％Tween20的pH7.2-8.8的0.01M-0.05M PBS缓冲液；其中所述的洗涤液为含有体积浓度为0.01-0.07％Tween20的pH7.2-8.8的0.01M-0.05M PBS缓冲液。4.装置的装配取两层吸水滤纸垫于上述硝酸纤维素膜下方，再将滤纸与膜一齐装入并固定于塑料反应装置盒中。二、制备胶体金标记物混合液1.制备胶体金颗粒取0.01％的氯金酸水溶液，加热煮沸，快速加入1％枸橼酸三钠溶液，继续煮沸5分钟，使得胶体金的大小为20-60nm。2.制备胶体金标记液取颗粒大小为20-60nm的胶体金溶液，在磁力搅拌下缓慢加入鼠抗人IgM单抗，使其最终浓度为20-80μg/ml。室温下搅拌30分钟。加入10％BSA溶液使其终浓度为0.2-1.0％，室温下搅拌5分钟。加入10％PEG20000溶液使其终浓度为0.1-0.5％，室温下搅拌5分钟。12000-15000r/min离心60分钟，仔细吸取上清，弃去。沉淀溶本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于同时检测四种致畸胎疾病ＴｏＲＣＨ的试剂盒，该试剂盒由免疫渗滤金标法联检反应装置、缓冲液和胶体金标记液组成，其特征在于：（１）其中所述的免疫渗滤金标法联检反应装置中的硝酸纤维素膜上，相距一定距离点制有ＨＣＭＶ基因工程抗原、ＨＳＶ基 因工程抗原、ＲＶ基因工程抗原和ＴＯＸ基因工程抗原四种蛋白和质控物羊抗鼠ＩｇＭ抗体；（２）其中所述的胶体金标记液是鼠抗人ＩｇＭ单抗的胶体金标记物。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：胡赓熙，
申请(专利权)人：上海数康生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：31[中国|上海]