生理学上可接受的强酸加成盐形式的在其N-末端含有一个谷氨酸或一个谷氨酰胺的药用分子制造技术

本发明专利技术涉及以生理上可接受的强酸加成盐形式存在的在其Ｎ－末端含有一个谷氨酸或一个谷氨酰胺的药用分子，优选地是主要组织相容性复合体（ＭＨＣ）配体，以及含有这样一种配体的疫苗。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】
本专利技术涉及的主题是一种以生理学上可接受的强酸加成盐形式存在的在其N-末端含有一个谷氨酸或一个谷氨酰胺的药用分子，优选地是一种针对主要组织相容性复合体(MHC)的配体，以及含有这样一种配体的疫苗。接种疫苗是一种预防或降低病毒或细菌感染的有效方法。当将疫苗抗原单独施用于宿主时，其免疫原性常常不足以诱导免疫应答，因此需要与一种佐剂结合或与一种载体蛋白偶联从而激发(或增强)它们的免疫原性。在这些条件下，只有体液型免疫应答可以被诱导。然而，在抗病毒的治疗中，产生能够识别和破坏病毒的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)是最重要的(Bachmann等，欧洲免疫学杂志(Eur.J.Immunol.)，1994，24，2228-2236；Borrow P.，肝病毒学杂志(JVirol Hepat.)，1997，4，16-24)，正如许多研究所证实，这些研究结果表明体内针对病毒表位的应答的保护作用(Arvin A.M.，感染疾病杂志(J.Inf.Dis.)，1992，166，35-41页；Koszinowski等，免疫学通讯(Immunol.Lett.)，1987，16，185-192)。CTL和辅助T细胞应答的重要性还被记载用于制备抗寄生虫如引起疟疾的恶性疟原虫的疫苗(Le等，疫苗(Vaccine)，1998，16，305-312)。CTL应答的重要作用还在抗肿瘤应答中得到有力证实，特别是针对黑素瘤细胞的应答(Rivoltini等的综述，Crit.Rev.Immunol.，1998，18，55-63)。已经确定了针对几种抗原的CTL表位(与I型分子相互作用且被呈递给CD8+T淋巴细胞的肽序列)。然而，由于这些肽的低免疫原性，体内产生CTL相当困难(Melief，癌症研究进展(Adv.Cancer Res.)，1992，58，143-175；Nandaz和Sercaz，细胞(Cell)，1995，82，13-17)。多数MHC(I型和II型)的配体特别是CTL表位肽的配体已得到鉴定(HG Rammensee等，免疫遗传学(Immunogenetics)，1999，50，213)，在Internet网上的公共数据库中能够得到一些它们的序列。特别要提到的数据库是SYFPEITHI(http//www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/)和MHCPEP(http//wehih.wehi.edu.au/mhcpep/)。同样也记载了主要HLAs的超型(supertype)(Sette等，免疫遗传学(Immunogenetics)，1999，50，201-212)。这些MHC配体的重要性通过越来越多的对这些化合物的人体临床研究得到了证实，其中这些化合物作为候选疫苗针对各种病变，具体作为抗-黑素瘤疫苗(表位m27-25 MART 1，g209-217，g280-288，gp100，MAGE 3)、作为抗-HIV疫苗(Klinguer等，疫苗(Vaccine)，2000，18，259-267)或作为抗-HBV脂肽型的抗-HBV疫苗(Livingston等，免疫学杂志(J.Immunol.)，1999，162，3088-3095)。然而，这些研究的困难在于所使用的肽在对患者进行用药前难以保存，因而导致它们的疫苗效力下降以及导致在体内更快被降解。为了使适于人体施用的盐的形式的且在其N-末端含有一个谷氨酸或一个谷氨酰胺的药用肽具有稳定性，本
的技术人员通常使用的方法是合成该肽的焦谷氨酸衍生物，如以下两例布舍瑞林和戈那瑞林所示(LH-RH类似物，欧洲药典，1999) 布舍瑞林 戈那瑞林此外这使得通过限制N-氨基肽酶对其的蛋白降解反应来延长所述肽的半衰期具有可能性。然而，当该方法被用来稳定MHC配体如ELA十肽(序列为ELAGIGILTV以及分子式为C45H80N10O14＝985 Da的CTL表位)时，所获得的PyrELA衍生物(序列为PyrELAGIGILTV以及分子式为C45H78N10O13＝967 Da)不再具有所需的疫苗活性，而且从CTL应答的角度来看实际上是无活性的。然而这种结构上的改变是较小的涉及谷氨酸的N-端α-氨基功能团与其自身的γ-羧基功能团的环化以及失去一分子水的反应。实际上，在N-末端具有一个谷氨酸(Glu，E)或谷氨酰胺(Gln，Q)型氨基酸的肽与游离的γ-羧酸功能团按照下述反应式发生环化从而形成焦谷氨酸 谷氨酸X＝OH 焦谷氨酸谷氨酰胺X＝NH2这些肽缺乏疫苗活性令人更吃惊，因为ELA十肽与获得的PyrELA衍生物之间质量仅仅减少了18道尔顿，而其余结构仍保持不变肽ELA MW＝985 肽Pyr-ELA MW＝967 肽Ac-ELA MW＝1027 还观察到合成在谷氨酸的胺功能团上被乙酰化的另一个ELA肽的衍生物(序列为AcELAGIGILTV和分子式为C47H82N10O15＝-1027 Da的AcELA肽，参见上文)以避免环化形成焦谷氨酸，可解决稳定性的问题，但却导致如此获得的AcELA衍生物丧失全部的疫苗活性，特别是丧失产生CTL细胞的活性。然而这种乙酰化反应只是本
的技术人员为了提高肽稳定性而通常采用的对肽结构进行的较小的改变(Brinckerhoff等，国际癌症杂志(Int.J Cancer)，1999，83，326)涉及N-端NH2功能团的质子之一被一个乙酰基团CH3CO所取代，质量略有增加(比985 Da高42 Da)，其余结构保持不变。同样，Elliott等(疫苗(Vaccine)，1999，17，2009-2019)已经记载了N-端位置含有蛋氨酸(氧化成亚砜)或谷氨酸的CTL表位(来自流感病毒的流感蛋白NSP-1(152-160位氨基酸)并且对应于限制酶切H-2Kk小鼠CTL表位的肽EEGAIVGEI)的稳定性问题。已经观察到当该肽与一种Montanide ISA 720型的佐剂溶液配制在一起时，该肽自动发生环化而形成焦谷氨酸(2个月内达到30％)。该作者提出了这样一个问题该降解与所需的疫苗活性有关，而不向其提供一种溶液。另外，几乎所有通过化学合成得到的肽在被冻干之前，都借助于含有三氟乙酸(TFA)的洗脱液进行反相HPLC纯化。经纯化的肽带有正电荷并且以三氟乙酸盐(RNH3+，CF3CO2-)的形式存在。三氟乙酸盐的量以及残余三氟乙酸的量总体上与序列中所含的碱性氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)以及N-端氨基酸的胺功能团的数量成比例。三氟乙酸盐形式的肽通常被用于体外和动物体内的临床前试验。但是对于作为人用药物，由于三氟乙酸属于一类其毒理学没有经过很好证实的溶剂(IV类)的一部分(Leblanc等，STP Pharma，1999，9，334-341)，该盐形式是不能接受的，特别是在最后纯化步骤中。因此，如同欧洲药典专著(Ph.Eur.1999)中可以看到的一样，没有一种获准上市的肽(生长抑素、Tetracoside、去氨加压素、降钙素、布舍瑞林、戈那瑞林等)是三氟乙酸盐的形式，而都是乙酸盐的形式。这些肽中允许的残余三氟乙酸的量实际上是非常有限的。而且，最近的研究(Cornish等，美国内分泌代谢生理学杂志(Am.J Physiol.Endocri本文档来自技高网...

【技术保护点】
在其Ｎ－末端含有一个谷氨酸或一个谷氨酰胺的药用分子，其特征在于所述分子以生理学上可接受的强酸加成盐的形式存在。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】...

【专利技术属性】
技术研发人员：C克林古尔哈姆尔，N科瓦伊亚，A贝克，L高什，
申请(专利权)人：皮埃尔法博赫药品公司，
类型：发明
国别省市：FR[法国]