新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒制造技术

本发明专利技术提供一种新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒，其中包括：包被有生物素‑链霉亲和素标记的人ACE2蛋白的酶标板、辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白、新型冠状病毒中和性抗体阳性对照、包被液、洗涤液、稀释液、封闭液、显色液和终止液等。该试剂盒具有成本低，操作简单，高灵敏度、高特异性、高准确度的特点，可用于新型冠状病毒中和抗体的批量、快速检测。

【技术实现步骤摘要】
新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒
本专利技术涉及免疫检验
，具体地说，涉及一种新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒。
技术介绍
新型冠状病毒SARS-CoV-2(即2019-nCoV)是2019年新发现的一种病毒，可导致人类病毒性肺炎或肺部感染。冠状病毒基因组依次编码为棘突蛋白、包膜蛋白、膜蛋白和核衣壳蛋白。其中棘突蛋白是冠状病毒最重要的表面膜蛋白，含有两个亚基，S1亚基与S2亚基。其中S1主要包含有受体结合区（receptorbindingdomain，RBD），负责识别细胞的受体。SARS-CoV-2的刺突蛋白与人血管紧张素转化酶2（Angiotensin-convertingenzyme2，ACE2）蛋白互作来感染人的呼吸道上皮细胞。棘突蛋白负责新冠病毒与宿主细胞膜受体结合及膜融合，是新冠中和抗体的重要作用位点以及疫苗设计的关键靶点。新冠中和性抗体，可以阻断病毒刺突蛋白与人ACE2蛋白的结合，从而阻止病毒侵染人的呼吸道上皮细胞。在实际研发过程中，需要筛选具有中和能力的抗体，以达到治疗的目的。另外，新冠疫苗研制中也必须以能够成功诱导中和抗体（保护性抗体）作为有效预防新冠感染的前提。因此，亟需开发有效且便捷的方法来检测新冠病毒中和抗体。目前检测新型冠状病毒中和抗体的方法主要为活病毒或假病毒中和试验。由于复杂的细胞实验过程，并受限于安全与试剂耗材等因素，现有方法不适合高通量大规模的新冠病毒中和抗体筛选工作。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种具有成本低，操作简单，高灵敏度、高特异性、高准确度的酶联免疫吸附（ELISA）检测试剂盒，用于新型冠状病毒中和抗体的批量、快速检测。为了实现本专利技术目的，第一方面，本专利技术提供一种新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒，所述试剂盒包括：包被有链霉亲和素和生物素标记的人ACE2蛋白的酶标板、辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白、新型冠状病毒中和性抗体阳性对照（即新冠病毒中和抗体参考品）、包被液、洗涤液、稀释液、封闭液、显色液和终止液等。优选地，酶标板上包被的链霉亲和素的浓度为5ug/mL，生物素标记的人ACE2蛋白的浓度为2ug/mL，链霉亲和素与生物素标记的人ACE2蛋白的摩尔比为1:4。包被方法如下：酶标板先经过链霉亲和素(streptavidin，缩写SA)溶液包被过夜，用洗涤液洗板后，加入生物素标记的人ACE2蛋白，用封闭液进行封闭并洗涤后密封保存。优选地，所述辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白中，辣根过氧化酶与RBD蛋白的摩尔比为4:1。辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白的使用浓度为50ng/mL。本专利技术中，不局限于使用辣根过氧化酶（HRP）标记新冠病毒刺突蛋白RBD，还可以用FITC、PE等标记RBD蛋白。本专利技术中，所述新型冠状病毒中和性抗体阳性对照来自于新冠康复患者，测定其可变区序列并通过重组形成的，该阳性对照购自上海祥耀生物科技有限公司。优选地，所述包被液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，具体成分为：15mMNa2CO3，35mMNaHCO3，pH9.6。优选地，所述洗涤液为：20mMTris，150mMNaCl，0.5%v/vTween-20，pH7.4。优选地，所述稀释液为含0.5％牛血清白蛋白的洗涤液。优选地，所述显色液为：50mMNa2HPO4·12H2O+25mM柠檬酸（C6H8O7）+40mg/mLTMB+3%v/vH2O2，pH5.5。优选地，所述终止液为1M硫酸溶液。本专利技术中，所述酶标板可以是96孔板。辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白和新型冠状病毒中和性抗体阳性对照，在试剂盒中优选为冻干粉形式。冻干粉中含有10%海藻糖（冻干保护剂）。第二方面，本专利技术提供新型冠状病毒中和性抗体的ELISA检测方法。本专利技术试剂盒的检测原理为：酶标板上的每个实验孔与阳性对照孔均包被有等量的生物素-链霉亲和素标记的人ACE2蛋白，设置阴性孔（不含有生物素标记的人ACE2蛋白），加入待测样本和新冠病毒中和抗体阳性对照以及恒定量HRP标记的新冠刺突蛋白RBD，HRP标记的新冠刺突蛋白RBD与待测新冠中和抗体相互竞争与固相抗原（人ACE2蛋白）反应，由于每个孔中的固相抗原和加入的HRP标记的新冠刺突蛋白RBD含量均恒定，所以当待测的新冠中和抗体浓度高时，则被结合在固相抗原上的HRP标记的新冠刺突蛋白RBD含量少，用洗涤液洗涤后加入显色液，显色反应浅，用酶标仪检测的OD值低，表明抑制率高；反之，当待测新冠中和抗体浓度低时，则所测的OD值高，抑制率低。通过用已知的新冠中和抗体（阳性对照）浓度检测所绘制的标准曲线，可以推算出待测新冠病毒中和抗体的中和能力以及给予疫苗后，是否产生了保护性抗体及滴度。中和性抗体的判定标准如下：中和活性：当待测样本OD值低于阳性孔时，判定为中和性抗体，用“+”表示。非中和活性：当待测样本OD值等于阳性孔时，判定为非中和性抗体，用“-”表示。无效：当阳性对照孔不显色或显色但OD值低于2.0时，该次实验判为无效。借由上述技术方案，本专利技术至少具有下列优点及有益效果：（一）本专利技术以生物素-链霉亲和素标记的人ACE2蛋白为包被抗原，以康复病人体内的抗体为阳性中和抗体作为试剂盒参照品，通过与新冠刺突蛋白RBD竞争结合生物素标记的人ACE2蛋白，从而筛选出具有中和能力的中和抗体以及疫苗给药后产生保护性抗体的滴度。（二）本专利技术提供的检测试剂盒能准确灵敏地检测不同基质，如血清中的新冠中和抗体的中和能力以及抗体滴度，样品的前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量的样品，样品检测成本远低于传统活病毒或假病毒检测方法。本专利技术对于大批量样品的新冠病毒中和抗体检测具有重要意义。（三）本专利技术蛋白试剂为冻干成分保存时间长，液体无放射性污染。（四）本专利技术中，生物素标记的人ACE2蛋白是采用体内酶标方式得到的，为生物素单点定点标记，具有批间差异小，重复性好的特点，与酶标板中的SA定点结合后，具有良好的空间结构，灵敏度更高。（五）本专利技术中，新冠病毒刺突蛋白RBD优选用辣根过氧化酶标记，操作简单。附图说明图1为本专利技术较佳实施例中绘制的新冠病毒中和抗体检测标准抑制曲线。具体实施方式本专利技术中所用的蛋白组分，如SA、HRP标记的新冠刺突蛋白RBD和生物素标记的人ACE2蛋白均利用人HEK293细胞表达，可维持天然蛋白结构。SA，生物素标记的人ACE2蛋白的包被量采用棋盘法依照灵敏度，检测范围为指标进行选择。HRP标记的新冠刺突蛋白RBD使用量的优化：在酶标板中加入不同浓度的HRP标记的新冠刺突蛋白RBD，选择HRP标记的新冠刺突蛋白RBD使用量为其与包被抗原结合恰好饱和的量。本专利技术采用竞争ELISA方法，新冠病毒中和性抗体可阻断新冠刺突蛋白RBD与人ACE2蛋白的结合，并进行灵敏度、特异本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有链霉亲和素和生物素标记的人ACE2蛋白的酶标板、辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白、新型冠状病毒中和性抗体阳性对照、包被液、洗涤液、稀释液、封闭液、显色液和终止液；/n酶标板上包被的链霉亲和素的浓度为5ug/mL，生物素标记的人ACE2蛋白的浓度为2ug/mL，链霉亲和素与生物素标记的人ACE2蛋白的摩尔比为1:4；/n所述辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白中，辣根过氧化酶与RBD蛋白的摩尔比为4:1；/n辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白的使用浓度为50ng/mL；辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白在试剂盒中为冻干粉形式，冻干粉中含有10%海藻糖；/n所述包被液为碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，具体成分为：15 mM Na

【技术特征摘要】
1.新型冠状病毒中和性抗体滴度检测ELISA试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：包被有链霉亲和素和生物素标记的人ACE2蛋白的酶标板、辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白、新型冠状病毒中和性抗体阳性对照、包被液、洗涤液、稀释液、封闭液、显色液和终止液；
酶标板上包被的链霉亲和素的浓度为5ug/mL，生物素标记的人ACE2蛋白的浓度为2ug/mL，链霉亲和素与生物素标记的人ACE2蛋白的摩尔比为1:4；
所述辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白中，辣根过氧化酶与RBD蛋白的摩尔比为4:1；
辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白的使用浓度为50ng/mL；辣根过氧化酶标记的新型冠状病毒RBD蛋白...

【专利技术属性】
技术研发人员：葛平菊，苗景赟，张兴琳，
申请(专利权)人：北京百普赛斯生物科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京;11