人骨髓瘤细胞系制造技术

提供用于产生人单克隆抗体的方法的人骨髓瘤细胞系。（*该技术在2021年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种人骨髓瘤细胞系。具体地说，本专利技术涉及人骨髓瘤细胞系在制造人杂交瘤的方法中的应用，所述人杂交瘤能够产生人单克隆抗体。背景Kohler和Milstein在1975年设计了用于提供小鼠单克隆抗体的技术(1，2)。在该方法中，免疫小鼠的产生抗体的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合，产生称为杂交瘤的杂交细胞。融合后，使用杀死所述骨髓瘤亲本细胞的药物选择所述细胞，而未融合的亲本脾细胞寿命有限，很快死亡，因此仅有杂交细胞存活下来。这些杂交瘤能够无限增殖并分泌抗体，所述抗体特异性针对用于免疫所述脾细胞供体的抗原。克隆产生具有所需特异性抗体的杂交瘤，获得产生均一抗体分子(即单克隆抗体)的杂交瘤细胞系。人们已经进行了许多研究努力，试图应用该技术产生人单克隆抗体。使用小鼠骨髓瘤获取人单克隆抗体的尝试是不成功的，因为异种特异性杂交细胞快速丢失相关人类染色体。人们还尝试使用已知的分泌抗体的人骨髓瘤细胞系(例如分泌IgEλ的U266人骨髓瘤细胞系，以及包含类淋巴母细胞和浆母细胞的异质混合物的RPMI-8226细胞系(3))产生人单克隆抗体，但这些尝试都失败了，尽管早期报道是有希望的。由于未曾成功获得产生人抗体的杂交瘤，因此人们已经考虑各种可替代的细胞系。例如，已经使用EB病毒(EBV)使产生抗体的人外周血B淋巴细胞无限增殖。然而，与产生小鼠单克隆抗体的杂交瘤相比，这样的细胞系有许多缺点。例如，它们往往生长不稳定、抗体产量低，而且EBV并不优先使参与抗体反应的淋巴母细胞无限增殖(4)。也已经发展出产生具有人类特征的单克隆抗体的策略，所述策略绕过对产生抗体的人类细胞系的需求。例如，通过连接啮齿动物可变区和人类恒定区，已经“人源化”有用的小鼠单克隆抗体(嵌合抗体)(13)。这在某种程度上降低所述抗体的人抗小鼠免疫原性，但由于外源V-区框架的存在，仍然有残余的免疫原性。此外，其抗原结合特异性基本是小鼠供体的抗原结合特异性。CDR嫁接和框架操作(EP0239400)已经改进和改良抗体操作，达到可能产生人类药学应用可接受的人源化小鼠抗体的程度。然而，所述抗体特异性仍然由小鼠结合位点供体决定。此外，它们的产生涉及复杂的序列操作，并且费力繁重。已经发展用于在体外产生人单克隆抗原结合片段的噬菌体展示技术，可以回收所述抗原结合片段的V基因并工程化进抗体基因，以产生单克隆抗体(14)。然而，通过该途径产生人单克隆抗体是复杂多步骤的方法，并且由于所述抗体是作为随机产生序列的组合的结果在体外工程化，因此所述抗体不象天然抗体一样接受体内亲和性成熟。已经发展出包含人而不是小鼠免疫球蛋白基因的转基因小鼠品系(15)。该小鼠品系包含人类基因，产生人类抗体；然而，因为所产生的多样性并非在人宿主内选择，而是在小鼠宿主内选择，并且所述抗体在小鼠体内经受亲和性成熟，所以所述抗体并不是真正的人类抗体。从分析的观点看，已知方法没有一种能够揭示人对特异性抗原攻击的免疫反应。在聚合酶链反应(PCR)扩增后直接分析重链和轻链的基因已经成为用于表征化人类在某些状况下所表达的抗体的可选方法。该方法的缺点是缺乏重链-轻链配对的信息。用于产生单克隆抗体的小鼠杂交瘤方法有下面附加的好处(与上述基于非杂交瘤的方法相比)该方法能够优先使抗原激活的B细胞无限增殖，由此长期产生单克隆抗体。因此，需要一种产生人单克隆抗体的方法，该方法具有常规小鼠单克隆抗体产生方法的所有好处。专利技术简述本专利技术提供人骨髓瘤细胞系，所述细胞系能够以类似于制备小鼠单克隆抗体的常规方法中使用的小鼠骨髓瘤的方式作用。因此，本专利技术首次能够可靠产生真正的人杂交瘤和单克隆抗体。因此，本专利技术涉及能够使用标准技术与人淋巴细胞融合产生杂交细胞的人骨髓瘤细胞系，所述标准技术例如聚乙二醇(PEG)融合方法、应用失活仙台病毒(2)或应用电融合方法(17)。本专利技术的专利技术人还发展出产生具有相当生长优势(即倍增时间比来自骨髓瘤患者的初级浆细胞培养物更短)的骨髓瘤细胞系的方法。本专利技术的人骨髓瘤细胞系能够用作通用抗体产生细胞。例如，通过用已知抗体基因转染所述骨髓瘤细胞系，能够产生以前特征鉴定的抗体。因为所述骨髓瘤细胞所产生的翻译后蛋白可能与人抗体产生细胞所产生的蛋白相同，所以所述骨髓瘤细胞系适于“生理性”抗体产生。然而，在一个优选实施方案中，本专利技术的骨髓瘤细胞系用于产生人杂交瘤的方法，所述人杂交瘤能够产生人单克隆抗体。因此，本专利技术的其它方面涉及一种产生杂交瘤的方法，所述方法包括将人骨髓瘤细胞系与人淋巴细胞融合的步骤；一种通过所述方法产生的人杂交瘤细胞系；一种由所述杂交瘤产生的人单克隆抗体。本专利技术的杂交瘤产生方法可以用于无限增殖化产生在病理状况下由天然机体反应激发的人抗体。这使得能够随时间监控免疫反应，同时提供抗体来源，与通过其它方法制备的抗体相比，所述抗体更可能用于治疗。对所述抗体特异性的分析能够用于提供在体内激发所述抗体的疾病特异性抗原的信息。所述信息能够再用于设计基于抗原的治疗策略，例如改良疫苗。图2分析骨髓瘤Karpas707细胞系和杂交瘤分泌的免疫球蛋白。所述细胞以2×106细胞/ml的浓度培养在补充10％透析的胎牛血清和250μCi/ml甲硫氨酸和半胱氨酸(Amersham International)的L-甲硫氨酸、L-半胱氨酸缺陷型培养基上培养。所述细胞在CO2培养箱中在37℃下温育8小时。温育后，所述细胞悬浮液在1000g离心5分钟。完全还原后通过十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳分析上清。通过免疫固定确认放射标记的分泌Ig的成分。组别1 骨髓瘤细胞产生的小量κ轻链2 与gp41 HIV-1反应的IgG，所述gp41 HIV-1由与164形成的杂交细胞产生。3，4 通过将骨髓瘤细胞与新鲜白细胞融合形成的产生IgG的杂交瘤。5，8，9，16 与扁桃腺细胞形成的产生IgG的杂交瘤。6，7 仅分泌κ轻链的与扁桃腺细胞形成的两个杂交瘤。10-12与新鲜扁桃腺细胞形成的杂交瘤所分泌的IgM。带12指出该杂交瘤分泌两种轻链。13 该杂交瘤看起来仅分泌两种轻链，因为它的重链G和M是阴性的。14 具有两种轻链的IgG，所述两种轻链由骨髓瘤和扁桃腺细胞之间的杂交细胞产生。15 与扁桃腺细胞形成的仅分泌高水平轻链的杂交瘤。图3a 接近四倍体的Karpas707细胞系的染色体核型。注意包含免疫球蛋白基因的染色体2、14和22是正常的并且是二倍体。83，XX，-X，-X，del(1)(p1lp36)x4，+del(1)(q11q44)，-2，-2，der(3)del(3)(p21p25)inv(3)(q23q25)，+del(3)(q13q21)，der(5)t(1；5)(p11；q31)，der(5)t(2；5)(q21；q31)，del(5)(q13q33)x2，+add(5)(q31)，-6，-6，add(7)(p25)，del(8)(q22q24)，-9，del(11)(q23q25)，-11，del(12)(p12p13)，-13，-13，-14，-14，add(15)(p11)x2，der(16)t(1；16)(p11；p11)，add(16)(p11)x2，-16，der(18)t(1；18)(q23；p11)，add本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于产生人单克隆抗体的方法的人骨髓瘤细胞系，所述细胞系已经通过多轮连续体外培养选择生长优势。

【技术特征摘要】
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【专利技术属性】
技术研发人员：A卡帕斯，
申请(专利权)人：剑桥大学技术服务有限公司，
类型：发明
国别省市：GB[英国]