重组猪流感病毒NP抗原、其制备方法及在诊断中的应用技术

重组猪流感病毒ＮＰ抗原、其制备方法及在诊断中的应用。Ａ型流感病毒基因组由８个分节段的ＲＮＡ组成，其中核蛋白（ＮＰ）具有型和种群特异性，是分型诊断的基础。本发明专利技术是重组猪流感病毒ＮＰ抗原，它采用大肠杆菌原核表达系统表达了我国猪流感病毒分离株完整的ＮＰ基因，利用表达的ＮＰ蛋白作为抗原检测Ａ型流感病毒感染产生的抗ＮＰ蛋白抗体，虽然Ａ型流感病毒亚型众多，但其ＮＰ基是流感病毒型的分类和诊断的基础，因此，基于重组ＳＩＶ核蛋白抗原建立的诊断技术可以检测猪、禽、马和人Ａ型流感病毒的感染。（*该技术在2023年保护过期，可自由使用*）

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及兽医生物
，利用大肠杆菌表达系统表达猪流感病毒(SIV)H3N2的NP蛋白，纯化后作为诊断用抗原。流感病毒是负链RNA病毒，病毒基因组是由8个分节段的RNA组成的，主要编码的病毒蛋白质有5种多肽，即血凝素(HA)，神经氨酸酶(NA)，基质蛋白(MA)，核蛋白(NP)和多聚糖(PB1、PB2、PA)。HA和NA是病毒的主要免疫原性蛋白，可诱导机体产生抗病毒感染的保护能力。NP具有型和种群特异性，是流感病毒分型和诊断的基础，但不是病毒的主要免疫原性蛋白。因此，利用NP检测流感病毒感染，不影响HA/NA亚单位疫苗或活载体疫苗免疫猪的鉴别诊断。
技术实现思路
本专利技术的目的是利用原核表达系统高效表达猪流感病毒的核蛋白作为抗原，建立猪流感病毒和其他A型流感病毒感染的抗体诊断技术。本专利技术的目的是这样实现的 重组猪流感病毒NP抗原，所述的抗原是诊断A型流感病毒感染的重组核蛋白抗原，它采用大肠杆菌原核表达系统表达了我国猪流感病毒(SIV)分离株(H3N2亚型)完整的NP基因，利用表达的NP蛋白作为抗原检测A型流感病毒感染产生的抗NP蛋白抗体。所述重组猪流感病毒NP抗原，采用大肠杆菌表达系统表达猪流感病毒H3N2亚型的NP蛋白，纯化后作为A型流感病毒感染诊断用抗原。一种重组猪流感病毒NP抗原的培养方法，利用RT-PCR方法克隆了分离于H3N2亚型猪流感病毒的NP基因，然后将完整的NP基因用限制性内切酶消化下来再与相同处理的原核表达载体pET30进行连接，获得含有SIV NP基因的表达质粒pETNP；用pETNP转化受体菌BL21，挑取单个菌落，用诱导剂以不同浓度进行诱导驯化，并在不同时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实NP的表达并确定IPTG的最佳诱导浓度及诱导时间分别为1mM和6小时；将SDS-PAGE后的蛋白带进行转膜，Western-blot试验证实了所表达的重组核蛋白大小相符具有反应活性。通过特异性、敏感性及工作条件的选择性实验，建立了猪流感病毒感染的重组核蛋白琼扩诊断技术。一种重组猪流感病毒NP抗原在诊断中的应用，该重组核蛋白抗原用于琼扩诊断技术(AGIP)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)，免疫荧光抗体检测(IF)及免疫印渍试验(Western Blot)。一种重组猪流感病毒NP抗原及其在诊断中的应用，该重组核蛋白抗原可用于检测A型流感病毒感染，包括猪流感病毒，禽流感病毒，马流感病毒和人流感病毒感染。本专利技术具有如下积极效果1.基于重组SIV核蛋白抗原的诊断技术的建立为在我国对猪流感的流行病学普查及现地养殖户对该病的诊断提供了重要的技术基础。2.所生产的重组核蛋白不仅生产容易，操作简单而且纯度较高，具有良好的特异性和敏感性。建立的琼扩诊断技术也易于被使用者接受。3.将重组核蛋白纯化后包被聚苯乙烯微量反应板也可建立敏感性更高的ELISA诊断方法。由于核蛋白是A型流感病毒型特异性抗原，基于重组SIV核蛋白抗原建立的诊断技术也可用于A型禽流感病毒、马流感病毒和人流感病毒感染的检测。4.建立了简单、方便、快速易于推广的猪流感诊断方法，解决了我国急需解决的主要问题。制作过程简单，而且成本低，便于推广使用。5.由于HA/HI技术除需要一定的技术条件外也容易产生非特异性的结果。而在原核表达系统中表达的核蛋白不仅表达量高而且具有生物反应活性，是近来用于生产诊断性抗原的一种新型方法，利用表达产物的生物活性可直接检测病毒的感染，而且所表达的重组蛋白融合了组氨酸标签，这同时也使蛋白质的纯化易于操作。为建立更为敏感的ELISA等诊断方法提供了技术支持。6.猪流感是一种世界性分布的群发性传染病，在中国猪流感不仅分布广而且发生频繁，对猪流感的防制其意义不仅在于兽医传染病学的意义，而且还有深远的公共卫生意义。猪流感是猪的主要免疫抑制病，除引起呼吸道疾病外也是规模化猪场中影响育肥猪的生长及导致母猪流产的主要诱因。猪在流感病毒“禽-猪-人”的种间传播链中，充当了病毒重组及复制的“混合器”。相对于禽流感，我国的猪流感的研究起步较晚，摆在科研工作者面前的任务也是任重道远。而对一种传染病的研究，首要是必须建立合适的诊断方法，从流行病学上完成该病的普查及为防制制定合理的程序，控制其流行达到预防的目的。本产品为防治工作开创了新的途径。7.猪流感病毒感染的重组核蛋白琼扩诊断技术的建立为在我国对该病的流行进行普查及及时准确的诊断和防止本病提供了技术基础。以猪流感病毒重组核蛋白为基础可以进行多方面的开发应用，例如a.以重组核蛋白为基础的琼扩诊断技术可实现对接种HA/NA亚单位疫苗或活载体疫苗的猪场猪流感感染的鉴别诊断；b.以重组核蛋白为基础可进行NP蛋白的纯化，进而可用于研究NP蛋白的功能结构等；c.以重组核蛋白为基础可进行NP蛋白的纯化，进而建立比琼扩更为敏感的ELISA，Dot-ELISA，免疫荧光和免疫印渍等诊断方法。图2，表达质粒pET-NP在受体菌BL21中诱导表达产物SDD-PAGE电泳结果。1.蛋白分子量Marker。2.空载体诱导产物对照；3-6.IPTG诱导不同时间后的表达产物。图3，猪流感病毒NP基因的原核表达及血清学诊断技术的构建流程图。本专利技术的具体实施例方式实施例1重组猪流感病毒NP抗原，所述的抗原是诊断A型流感病毒感染的重组核蛋白抗原，它采用大肠杆菌原核表达系统表达了我国猪流感病毒(SIV)分离株(H3N2亚型)完整的NP基因，利用表达的NP蛋白作为抗原检测A型流感病毒感染产生的抗NP蛋白抗体。实施例2所述重组猪流感病毒NP抗原，采用大肠杆菌表达系统表达猪流感病毒H3N2亚型的NP蛋白，纯化后作为A型流感病毒感染诊断用抗原。实施例3一种重组猪流感病毒NP抗原的培养方法，利用RT-PCR方法克隆了分离于H3N2亚型猪流感病毒的NP基因，然后将完整的NP基因用限制性内切酶消化下来再与相同处理的原核表达载体pET30进行连接，获得含有SIV NP基因的表达质粒pETNP；用pETNP转化受体菌BL21，挑取单个菌落，用诱导剂以不同浓度进行诱导驯化，并在不同时间收集样品。经SDS-PAGE电泳分析证实NP的表达并确定IPTG的最佳诱导浓度及诱导时间分别为1mM和6小时；将SDS-PAGE后的蛋白带进行转膜，Western-blot试验证实了所表达的重组核蛋白大小相符具有反应活性。通过特异性、敏感性及工作条件的选择性实验，建立了猪流感病毒感染的重组核蛋白琼扩诊断技术。实施例4一种重组猪流感病毒NP抗原在诊断中的应用，该重组核蛋白抗原用于琼扩诊断技术(AGIP)，酶联免疫吸附试验(ELISA)，斑点酶联免疫吸附试验(Dot-ELISA)，免疫荧光抗体检测(IF)及免疫印渍试验(Western Blot)。实施例5一种重组猪流感病毒NP抗原及其在诊断中的应用，该重组核蛋白抗原可用于检测A型流感病毒感染，包括猪流感病毒，禽流感病毒，马流感病毒和人流感病毒感染。实施例6重组SIV核蛋白抗原的表达和制备方法一，SIV的培养及RNA的提取取H1N1种毒尿囊腔接种9-11日龄SPF鸡胚，4天后收获尿囊液，低速离心后超速离心，无Rnase A的TE(PH＝8.0)缓冲液溶解沉淀本文档来自技高网...

【技术保护点】
重组猪流感病毒ＮＰ抗原，其特征是：所述的抗原是诊断Ａ型流感病毒感染的重组核蛋白抗原，它采用大肠杆菌原核表达系统表达了我国猪流感病毒（ＳＩＶ）分离株（Ｈ３Ｎ２亚型）完整的ＮＰ基因，利用表达的ＮＰ蛋白作为抗原检测Ａ型流感病毒感染产生的抗ＮＰ蛋白抗体。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：童光志，倪健强，李海燕，仇华吉，王云峰，
申请(专利权)人：中国农业科学院哈尔滨兽医研究所，
类型：发明
国别省市：93[中国|哈尔滨]