本发明专利技术公开了一种DNA固相扩增与流式检测分析技术及试剂盒的制备方法,该技术灵敏快速、信息量大,制造简便、成本低。主要特征在于以流式细胞仪为主要检测分析手段,把多种不同的信息编码技术用于各种固相合成与扩增产物,亲合吸附层析等制备过程中的固相分离物、微载体表面附着的微生物体以及各种固相基质微粒表面结合、吸附或包被的生物、化学分子等表面活性分子结构与特性等信息的编码,并将此编码微粒用于核酸、蛋白、药物和化学分子等的大规模检测分析与筛选。本发明专利技术可广泛地用于环境检测、生物医药研究、疾病诊断以及基因组、蛋白质组学和分子文库等领域。(*该技术在2022年保护过期,可自由使用*)
【技术实现步骤摘要】
本专利技术涉及一种高通量DNA固相扩增与流式检测分析技术及试剂盒的制备方法。该技术准确、灵敏、快速、信息量大,制备方法简便、成本低,能同时检测样品中多种不同的蛋白、核酸分子、生物化学分子、微生物或细胞等成分,可广泛地用于生物学、医药学、预防医学、动植物学、农牧业、食品与卫生、能源与化工、环境监测以及医学诊断与检测等领域。固相吸附、分离与合成技术在样品或样品溶液、生物体液(如血液、血清、血浆、脑脊液、尿液等,泪液、汗液、消化液和精液等分泌液,组织液、渗出液、呕吐物、粪便、组织/细胞匀浆液等)、微生物或细胞中的蛋白、核酸等生物、化学分子的检测、分析、分离、纯化以及蛋白多肽、寡核苷酸、先导化合物和药物的合成等方面已被广为应用。生物固相技术主要是利用不溶的固相基质材料,通过表面吸附或结合以捕获液相被分析物和被纯化物中的靶分子或固定新合成的靶分子,借助重力、压力、离心、过滤、磁力、流体等,经过一步或多步操作很方便的将未结合的分子(液相、游离相或流动相)与结合分子(固相)分离,以便获得纯的目的分子,或将靶分子从复杂的样品混合物或悬液中分离出来,用于进一步的分析研究。在样品的检测分析、分离纯化、合成等实验中,大部分情况下需要在同一个容器里、同时进行两项或多项实验,以便对样品中多种不同成分的有无、含量和来源等做出平行的比对以及定性、定量、定位等检测分析;或对单一种分子的多种不同特性(如单核苷酸多样性)进行平行检测与分析;或对多种物质同时进行分离纯化,或同时进行多种不同分子的合成。在此情况下,传统的固相吸附试验所存在的问题是对超过3种以上的不同被检测物,被纯化物或合成物由于难以区分,很难同时进行。也就是说,用传统的固相技术或方法,在一个容器或试验中被检测物、合成物或分离物的数量受固相系统的限制或制约,更无法同时或连续进行合成、分离与检测等操作。在现代基因组学、蛋白质组学、功能组学、组合化学的分析研究和生物医学诊断和新药研究开发中,需要同时对同一样品中大量的、多种不同生物、化学物质进行快速、灵敏的高通量合成、分离、纯化与检测,以分析生物、化学物资的种类、数量、组成、变异以及多态性、翻译后修饰、序列结构、不同生物分子间的相互作用,个体健康、感染状态与用药特性,个体免疫系统的功能状态、遗传差异等。传统解决办法是首先通过分离提取、纯化或人工合成等技术和工艺,分别进行大量制备,以获得各种不同的生物或化学分子(如核酸或寡核苷酸、蛋白与多肽、生长因子与受体、抗原与抗体等各种不同特性的生物分子);然后,再分别将生物分子探针固相化在不同的固相基质(如载玻片、微孔板或层析基质)的表面,与样品中对应的抗原抗体或核酸等化学物质分别反应,分别进行检测分析。由于合成与制备、分离与纯化同检测与分析等各个操作环节彼此互无联系、相互脱节,因此如要检测十几种成分就需进行十几次不同的合成、分离纯化与检测分析实验,异常繁琐复杂。特别是在抗体、单克隆抗体、基因工程抗体、生物药等的大规模制备中,需要对大量的细胞、细菌、真菌、支原体、立克次氏体和病毒等微生物体,尤其是带有大量特定的重组基于、蛋白、酶类、抗体、抗原表位,展示肽等生物分子的基因工程菌、生物工程细胞、转化细菌、转染和感染的真菌和动植物细胞以及重组质粒或病毒等进行高通量筛选与分析。这些工程微生物体除带有与自身生物学特性相关的生物分子外还带有插入基因、感染或转染病毒等所赋予的特殊生物分子,是生物、医学检测和分析及基础研究的重要生物材料。而现有的技术方法只能通过免疫细胞化学等方法逐一培养、固定以及筛选与检测分析,操作异常复杂、繁琐。如在组合化学等分子文库的研究中,Kits Lam等提出的一珠一物法,虽然可以很便捷地进行高通量筛选,但因必须对筛选出的阳性微珠所吸附的多肽或寡核苷酸逐一进行测序分析,费时费力;此后他们又提出了在一个微珠上同时进行寡核苷酸与多肽合成的方法,用寡核苷酸序列对氨基酸序列进行编码,或用氨基酸序列对寡核苷酸序列进行编码。该方法不仅没有减少对后续测序分析等的操作,而且还增加了前期的合成制造的成本与复杂性,不便进行产业化。本专利技术的目的就是要通过几种简单有效的位序编码方法和DNA固相合成与扩增技术为多种不同物质成分、特别是核酸、蛋白分子以及药物及其前体等的合成、分离与纯化、检测和筛选等提供一种制造成本低,便于产业化,而技术和工艺更为简便灵敏、快速准确;同时又可将三者有机结合,贯通一起的新的高通量筛选与检测分析技术。本专利技术的主要技术特征是,对固相自动合成、DNA固相扩增、以及固相分离纯化和微载体悬浮培养等所获得的保留在固相微粒表面的活性分子的结构、特性等运用不同的位序编码技术进行编码,配合高通量流式检测分析技术用于样品中的核酸、蛋白、多糖、脂类,多肽和寡核苷酸及其衍生物以及天然与仿生药物、药物前体与先导化合物等化学分子的大规模、高通量检测、分析与筛选。本项专利技术同时还提供了基于本项技术专利技术制备试剂盒的方法,其主要技术特征在于试剂盒由装有一定数量的、表面分别带有某种特定序列或结构的生物或化学分子的可编码固相微粒与各种相关的配套试剂共同或分别组成,以实现对同一样品或不同样品中同一成分或多种不同成分同时进行比对分析;同时利用试剂盒中所提供的试剂还可对各阳性微粒所捕获的样品成分,做分子克隆、分子结构、亲和力、分子量、等电点、序列测定等进一步分析。该试剂盒不仅大大简化了样品检测分析的操作步骤,缩短了操作时间,降低了工作强度,更增加了检测结果的精确性、灵敏度、重现性和可比性,而且还可同时对检测样品中不同的物质成分做各种进一步的分析,使用更方便,操作快捷,可广泛地应用于环境检测、疾病诊断、新药开发与筛选、疫苗研究、生物分子相互作用、基因组学、蛋白质组学和功能组学等技术、研究领域。为了达到上述目的,本专利技术所采用的技术方案其基本特征在于DNA固相扩增与流式检测分析技术及试剂盒的制备方法,至少包括下述成分或步骤①一定数量的可编码固相微粒,由可编码装置、基质、连接分子层以及位于表面的活性分子组成;可编码装置分内置式和外置式;内置式可编码装置由基质包裹,位于可编码固相微粒的核心;基质表面为连接分子层,可将相同或不同的表面活性分子连接在固相颗粒的表面;表面活性分子可与样品中的生物、化学分子特异结合或杂交在一个微粒表面通常只连接一种表面活性分子;②封闭为减少后续操作中可能存在的非特异性结合,用封闭液(如含添加剂的PBS、或HEPES等缓冲液)处理固相微粒,以封闭和去除其表面可能存在的非特异性结合位点;③编码根据可编码固相颗粒的数量、实验操作流程和位序等,按一定的方式将固相颗粒表面活性分子的结构、特性等生物、化学信息进行编码并存入可编码装置中;④样品固/液体标本、样品溶液、生物体液、微生物或细胞中的蛋白、核酸、各种组合化学库、分子库及展示系统中的蛋白多肽、寡核苷酸、先导化合物与合成药物分子库等的生物、化学分子,经过处理,如溶解、稀释、浓缩、裂解或匀浆、分离与纯化、去除颗粒和不溶成分、提取有效成分(如DNA,RNA,mRNA,蛋白和多肽、脂和脂类、糖和多糖等),反转录以及延长或扩增与标记等;或不经处理直接与各固相微粒表面的各种相同或不同生物、化学分子相互作用,样品中的被检分子或靶分子与各固相分子特异性杂交或结合;本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种可同时检测、分析和筛选样品中的核酸、蛋白与化学分子及药物分子的DNA固相扩增与流式检测分析技术及试剂盒的制备方法,该技术和试剂盒至少包括下述成分或步骤:①一定数量的可编码固相微粒,由可编码装置、基质、连接分子层以及表面活性分子组成; 可编码装置分内置式和外置式;内置式可编码装置由基质包裹,位于可编码固相微粒的核心;基质表面为连接分子层,可将相同或不同的表面活性分子连接在固相颗粒的表面;表面活性分子可与样品中的生物、化学或药物等分子特异结合或杂交;在一个微粒表面通常只连接一种表面活性分子;②封闭:为去除非特异性结合位点,用封闭液处理固相微粒表面;③编码:将表面活性分子的结构、特性等生物、化学信息进行编码并存入可编码装置中;④样品:经过处理或不经处理直接与各固相微粒表面连接的各种相同或不同的生物、 化学分子相互作用,并与之特异性杂交或结合的被检物;⑤标记:被检样品用指示性标记分子及其衍生物或标记物等进行标记;⑥漂洗:用洗液或洗脱液洗脱与固相微粒表面活性分子结合或非特异结合的各种分子;⑦检测与分析:对固相基质表面保留的标记分 子或标记物的有无、强弱以及含量进行检测和分析;⑧解码:识别可编码装置中存储的编码信号,将编码信号转换为固相微粒表面所结合的生物、化学分子的结构、特性等信息的可读数据。...
【技术特征摘要】
【专利技术属性】
技术研发人员:赵翀,
申请(专利权)人:赵翀,
类型:发明
国别省市:11[中国|北京]
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