鉴定布鲁氏菌病疫苗株与野毒株的引物、探针及试剂盒制造技术

本发明专利技术提供了一种鉴定布鲁氏菌病疫苗株与野毒株的引物、探针及试剂盒，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示，所述探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述的试剂盒包含上述引物和探针。既可鉴别纯布鲁氏菌核酸DNA，也可鉴别组织样本等微量布鲁氏菌核酸DNA，将牛种布鲁氏菌A19‑ΔVirB12分子标记疫苗免疫样品和布鲁氏菌现有疫苗免疫样品、野毒株感染样品区分开来。本方法具有安全性高操作便捷、灵敏度高、特异性强等优点，能同时检测大量样品，对布鲁氏菌病的防控和诊断具有实际应用价值。

【技术实现步骤摘要】
鉴定布鲁氏菌病疫苗株与野毒株的引物、探针及试剂盒
本专利技术属于分子生物学
，涉及一种鉴定布鲁氏菌病分子标记疫苗株与布鲁氏菌病现有疫苗株、野毒株的引物、探针及试剂盒，具体为一种鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫现有苗株及野毒株的实时荧光PCR特异性引物、探针及试剂盒。
技术介绍
布鲁氏菌病(Brucellosis)，简称布病，是一种由布鲁氏菌(Brucella)引起的人畜共患传染病。防控和诊断净化布病，是国家公共卫生安全和畜牧业健康发展的重要基础。目前国际和国内对于动物间布病的防控主要采用免疫布病弱毒活疫苗，国际上主要免疫S19、RB51、Rev1，我国目前主要使用的疫苗株有A19、M5和S2。这些疫苗在消灭及防控布鲁氏菌病疫情上，起到了很大的作用。但同时在使用过程中，也存在一些安全隐患：首先，无论国际和国内，目前均使用的是弱毒活疫苗，虽然其毒力有所减弱，但是对人依然存在一定的感染性；其次，在布鲁氏菌疫苗免疫动物后，存在疫苗免疫抗体和自然感染抗体无法区分，一定程度上对布病的净化和防控造成了影响。目前PCR方法已广泛应用于布鲁氏菌病的诊断以及病原体检测，其中实时荧光PCR因其灵敏度高，特异性强，耗时少，越来越多应用于布鲁氏菌的检测。然而现有的布鲁氏菌实时荧光PCR方法无法区分疫苗株与野毒株。针对以上情况，目前国内有一些研究机构开展了布鲁氏菌标记疫苗的研究，通过分子生物学手段，对布鲁氏菌某些基因进行标记或敲除，产生一些人为标记，从而达到鉴别诊断的目的。牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗目前已开展了新兽药的注册申报工作，其血清学鉴别方法已有相关专利。本专利技术能从分子生物学角度对布鲁氏菌阳性样品，进行牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗与布鲁氏菌疫苗株、野毒分离株的鉴别检测，对布鲁氏菌病的防控净化具有较大的意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一组特异性引物和探针，用于鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株。本专利技术的另一目的在于提供用于鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的试剂盒。本专利技术的另一目的在于提供鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的方法。为了达到上述技术目的，本专利技术具体通过以下技术方案实现：一种用于鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的引物，所述的引物为：VirB12-F：5’-GTGCGCTGGCTATCTATAA-3’，如SEQIDNO.1所示；VirB12-R：5’-GCATTTGATGCGTAATCTTT-3’，如SEQIDNO.2所示。一种用于鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的探针，所述探针VirB12-Probe的核苷酸序列为：ATTGGCTGATCAATCAAGGCGTACC，如SEQIDNO.3所示。所述的探针5’端标有FAM荧光报告集团，3’端标有BHQ1荧光淬灭集团。在本专利技术的另一方面，提供了一种用于鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的试剂盒，所述的试剂盒包含核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示的引物。所述的试剂盒还包含核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探针。进一步的，所述的试剂盒中还包括实时荧光定量PCR扩增试剂，比如2×ProbeTaqMix，所述的TaqProbe2×qPCRMasterMix含TaqDNAPolymerase、延伸促进因子、dNTP以及优化的缓冲体系。进一步的，所述试剂盒中还包括阳性对照品和阴性对照品。优选地，所述阳性对照品为含有VirB12基因片段布鲁氏菌DNA；所述的阴性对照品为灭菌的双蒸水。进一步的，所述的试剂盒还包括标准品，其为携带VirB12基因序列重组质粒。进一步的，所述的试剂盒20μL体系中引物和探针用量优选为：VirB12-F(10μM)0.2μL，VirB12-R(10μM)0.2μL，VirB12-Probe(10μM)0.2μL。在本专利技术的另一方面，还提供了鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的方法，包括以下步骤：1)建立标准曲线：将携带VirB12基因的重组质粒标准品，按照10倍梯度稀释至浓度为1×1010-1×101copies/μL，利用上述引物和探针进行荧光定量PCR检测，检测结束后，以各标准品的浓度log值(X轴)对其相应Ct值(Y轴)作图，绘制标准曲线；2)提取待检样本的DNA模板；3)利用上述引物和探针进行荧光定量PCR扩增，在荧光定量PCR仪上进行检测，选择荧光信号FAM和淬灭信号BHQ1，阈值设置为正常阴性样品的最高点；4)在检测结果成立的情况下，按照如下方法判断：当Ct值≤37且有扩增曲线的样本，判定为阳性，表示该样品为布鲁氏菌现有疫苗免疫样品或野毒株感染样品；当Ct值在38-40之间为灰色区域，判定为可疑，重新检测后Ct值＜37且有扩增曲线为阳性；无Ct值，判定为阴性，表示该样品为布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株免疫样品。进一步的，荧光定量PCR扩增反应体系为：2×ProbeTaqMix10μL，VirB12-F0.2L，VirB12-R0.2L，VirB12-Probe0.2μL，DNA模板1μL，ddH2O；反应条件为：95℃反应10min；95℃反应15s，65℃反应1min，重复40个循环。进一步的，结果有效性判定：阴性对照：无Ct值，无扩增曲线；阳性对照：Ct值≤30，扩增曲线明显呈对数增长。本专利技术的有益效果为：现有技术对布鲁氏菌的检测仅能判定待检样品是否存在布鲁氏菌，无法区分疫苗免疫与野毒株感染，本专利技术利用牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗的序列特性，设计特异性引物及探针，提供一种快速鉴别牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌现有疫苗株、野毒株的实时荧光PCR方法。可鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗免疫样品与布鲁氏菌现有疫苗免疫样品、自然感染样品，对布鲁氏菌病的追踪溯源和防控净化具有实际应用价值。检测反应具有特异性高，灵敏度好的特点，检测下限可达1000copies/反应体系，且检测快速、高效。附图说明图1是本专利技术布鲁氏菌VirB12基因扩增标准曲线图；图2是不同疫苗株的实时荧光PCR检测，其中，1-3分别为牛种布鲁氏菌A19疫苗株基因组DNA、羊种布鲁氏菌M5疫苗株基因组DNA和布鲁氏菌野毒分离株基因组DNA，4-8分别为牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株基因组DNA、大肠杆菌基因组DNA(E.coli)、金黄色葡萄球菌基因组DNA(SA)、阴性对照本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1～2所示。/n

【技术特征摘要】
1.一种用于鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的引物，其特征在于，所述引物的核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示。


2.一种用于鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的探针，所述探针的核苷酸序列如SEQIDNO.3所示。


3.一种用于鉴别牛种布鲁氏菌A19-ΔVirB12分子标记疫苗株与布鲁氏菌疫苗株及野毒株的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含核苷酸序列如SEQIDNO.1～2所示的引物。


4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含核苷酸序列如SEQIDNO.3所示的探针。


5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒中还包括实时荧光定量PCR扩增试剂2×ProbeTaqMix。


6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为含有VirB12基因片段布鲁氏菌DNA，所述的阴性对照品为灭菌的双蒸水。


7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒还包括携带VirB12基因序列重组质粒得标准品。


8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒为20μL体系，引...

【专利技术属性】
技术研发人员：叶锋，马晓菁，谷文喜，刘丽娅，易新萍，谢彩云，陈荣贵，刘帅，钟旗，古丽努尔·吐尔逊，张旭，
申请(专利权)人：新疆畜牧科学院兽医研究所新疆畜牧科学院动物临床医学研究中心，
类型：发明
国别省市：新疆;65