一种透明质酸或其盐酶降解的方法技术

本申请涉及一种透明质酸或其盐酶降解的方法。该方法包括：底物溶液配制：混合葡萄糖氧化酶、葡萄糖、透明质酸或其盐和水以生成底物溶液；酶解：向底物溶液加入透明质酸酶或硫酸软骨素酶进行酶解，得到酶解液；纯化：对酶解液进行灭活得到低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。本申请的方法中添加了葡萄糖氧化酶，提高了透明质酸酶的活性，并去除透明质酸/盐酶解液中的氧气，减少或防止氧化褐变的发生，同时显著抑制酶解液中细菌的生长，酶解过程中不用额外添加防腐剂，提高低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的品质。

【技术实现步骤摘要】
一种透明质酸或其盐酶降解的方法
本申请总地涉及透明质酸制备及纯化领域，具体涉及一种透明质酸或其盐酶降解的方法。
技术介绍
透明质酸(Hyaluronicacid，简称HA)又名玻璃酸或玻尿酸，是由(1-3)-2-乙酰氨基-2-脱氧-D-葡萄糖(1-4)-D-葡萄醛酸双糖重复单位所组成的高分子量的直链粘多糖，广泛地存在于人、动物的玻璃体、皮肤、脐带中，为人体中不可或缺的关键功能物质。透明质酸根据其分子量的不同，具有很多不同的功能。通常，我们将分子量≥1000KDa的透明质酸定义为高分子透明质酸，把分子量10KDa～1000KDa的透明质酸定义为低分子透明质酸，分子量≤10KDa定义为寡聚透明质酸。随着透明质酸分子量的降低，尤其是当分子量降低至10KDa以下时，透明质酸越来越容易被氧化从而发生氧化褐变，最终导致透明质酸溶液颜色变深，醇沉出来的粉末白度降低变黄。而采用透明质酸酶或者硫酸软骨素酶制备低分子及寡聚透明质酸及其盐结束时，需要对透明质酸酶进行灭活处理。传统的方法为高pH或者高温灭活，但是高pH或者高温的条件下，低分子及寡聚透明质酸及其盐更容易发生氧化褐变。而采用低pH灭活透明质酸酶又会对酶解用设备造成严重腐蚀。如何在透明质酸及其盐酶解及酶灭活过程中对透明质酸进行抗氧化保护，成为一个难题。另外，HélèneLenormand在2009年(Thehyaluronan–proteincomplexesatlowionicstrength:Howthehyaluronidaseactivityiscontrolledbythebovineserumalbumin,MatrixBiologyVolume28,Issue6,July2009,Pages365-372)报道当透明质酸酶与透明质酸的比例较低时，透明质酸会和透明质酸酶形成没有活性的络合物，严重降低透明质酸酶的酶解活性。随着透明质酸分子量的降低，络合物逐渐解离，将透明质酸酶释放出来。实验表明，在透明质酸酶解液中添加非催化蛋白，例如牛血清白蛋白(BSA)，这些蛋白质可以与透明质酸酶产生竞争作用，从而解放了酶解液中的透明质酸酶，恢复透明质酸酶的活性，但BSA浓度过高也会导致透明质酸酶活性的降低。此外，牛血清白蛋白价格昂贵，无法大规模应用于透明质酸酶解生产过程中。
技术实现思路
本申请的目的在于提供一种透明质酸或其盐酶降解的方法。本申请提供了一种透明质酸或其盐酶降解的方法，包括：底物溶液配制：混合葡萄糖氧化酶、葡萄糖、透明质酸或其盐和水以生成底物溶液；酶解：向所述底物溶液加入透明质酸酶或硫酸软骨素酶进行酶解，得到酶解液；纯化：对所述酶解液进行灭活得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。可选地，根据上述的方法，所述纯化为向所述酶解液加入乙醇得到混合液，搅拌，过滤得到包含所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的过滤液。优选地，所述乙醇在所述混合液中的体积百分比浓度为20％～50％。更优选地，所述乙醇在所述混合液中的体积百分比浓度为20％～35％。可选地，根据上述的方法，在所述纯化后还包括沉淀和脱水干燥。优选地，所述沉淀为向所述过滤液加入有机溶剂，混合均匀，得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的沉淀。优选地，所述脱水干燥为将所述沉淀分离出来，脱水干燥，得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。可选地，根据上述的方法，在所述沉淀中，所述乙醇的添加量为所述过滤液体积的3～20倍。可选地，根据上述的方法，所述葡萄糖氧化酶为任意来源的葡萄糖氧化酶。所述葡萄糖氧化酶优选为已商品化的葡萄糖氧化酶。更优选为食品级或优级纯葡萄糖氧化酶。还优选为青霉生产的葡萄糖氧化酶。可选地，根据上述的方法，所述葡萄糖氧化酶的酶活单位≥10万U/g。可选地，根据上述的方法，所述葡萄糖氧化酶的添加量为每1000L所述底物溶液中加入10g～100g所述葡萄糖氧化酶。优选为每1000L所述底物溶液中加入10g～50g所述葡萄糖氧化酶。可选地，根据上述的方法，所述透明质酸或其盐为任意高分子透明质酸或高分子透明质酸盐，任意低分子透明质酸或低分子量透明质酸盐。可选地，根据上述的方法，所述透明质酸或其盐在所述底物溶液中的质量体积浓度为5％～30％。可选地，根据上述的方法，所述葡萄糖在所述底物溶液中的质量体积浓度为0.1‰～1‰。优选为0.1‰～0.4‰。可选地，根据上述的方法，所述透明质酸酶或硫酸软骨素酶为微生物产透明质酸酶、蛇毒来源透明质酸酶、水蛭来源透明质酸酶、哺乳动物来源透明质酸酶或硫酸软骨素酶。更优选为芽孢杆菌(Bacillussp.)产透明质酸酶。最优选为芽孢杆菌(Bacillussp.)A50，CGMCCNO.5744发酵生产的透明质酸酶。可选地，根据上述的方法，所述透明质酸酶或硫酸软骨素酶的添加量为每1kg所述透明质酸或其盐加入1×107～5×109IU的所述透明质酸酶或硫酸软骨素酶。本申请通过在透明质酸/盐酶解制备低分子及寡聚透明质酸/盐的过程中，创新性地添加葡萄糖氧化酶，防止透明质酸酶/透明质酸/盐比例过低时，透明质酸酶与透明质酸/盐络合物的产生，提高了酶解效率。本申请通过在透明质酸/盐酶解制备低分子及寡聚透明质酸/盐的过程中，创新性地添加葡萄糖氧化酶及葡萄糖，去除了酶解液中的氧气，降低了低分子及寡聚透明质酸/盐的氧化褐变。酶解结束后，本申请采用低度乙醇对透明质酸酶及葡萄糖氧化酶进行灭活及过滤去除，进而通过醇沉、干燥获得最终的低分子及寡聚透明质酸盐，摒弃了传统的碱性灭活或者高温灭活的方式，避免了碱性灭活或者高温灭活酶时对低分子及寡聚透明质酸/盐的氧化。附图说明图1为本申请实施例的透明质酸或其盐酶降解的方法流程示意图。具体实施方式以下结合附图和实施例，对本申请的具体实施方式进行更加详细的说明，以便能够更好地理解本申请的方案以及其各个方面的优点。然而，以下描述的具体实施方式和实施例仅是说明的目的，而不是对本申请的限制。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本申请提及的方法中各步骤的执行顺序，除特别说明外，并不限于本文的文字所体现出来的顺序，也就是说，各个步骤的执行顺序是可以改变的，而且两个步骤之间根据需要可以插入其他步骤。针对酶解工艺制备透明质酸时，透明质酸/盐和透明质酸酶形成没有活性的络合物，透明质酸/盐易产生氧化的问题，专利技术人在透明质酸/盐酶解液中添加葡萄糖氧化酶，一方面葡萄糖氧化酶与透明质酸/盐提前结合，拮抗透明质酸酶-透明质酸/盐络合物的形成，提高了透明质酸酶的活性；另一方面可以去除透明质酸/盐酶解液中的氧气，减少或防止氧化褐变的发生，同时显著抑制酶解液中细菌的生长，酶解过程中不用额外添加防腐剂，提高低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的品质。...

【技术保护点】
1.一种透明质酸或其盐酶降解的方法，其特征在于，包括：/n底物溶液配制：混合葡萄糖氧化酶、葡萄糖、透明质酸或其盐和水以生成底物溶液；/n酶解：向所述底物溶液加入透明质酸酶或硫酸软骨素酶进行酶解，得到酶解液；/n纯化：对所述酶解液进行灭活得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。/n

【技术特征摘要】
1.一种透明质酸或其盐酶降解的方法，其特征在于，包括：
底物溶液配制：混合葡萄糖氧化酶、葡萄糖、透明质酸或其盐和水以生成底物溶液；
酶解：向所述底物溶液加入透明质酸酶或硫酸软骨素酶进行酶解，得到酶解液；
纯化：对所述酶解液进行灭活得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。


2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化为向所述酶解液加入乙醇得到混合液，搅拌，过滤得到包含所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的过滤液；
优选地，所述乙醇在所述混合液中的体积百分比浓度为20％～50％；
更优选地，所述乙醇在所述混合液中的体积百分比浓度为20％～35％。


3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在所述纯化后还包括沉淀和脱水干燥；
优选地，所述沉淀为向所述过滤液加入有机溶剂，混合均匀，得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐的沉淀；
优选地，所述脱水干燥为将所述沉淀分离出来，脱水干燥，得到所述低分子透明质酸或寡聚透明质酸或其盐。


4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在所述沉淀中，所述有机溶剂的添加量为所述过滤液体积的3～20倍。


5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述葡萄糖氧化酶为任意来源的葡萄糖氧化酶，所述葡萄糖氧化酶优选为已商品化的葡萄糖氧化酶；更优选为食品级或优级纯葡萄糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：乔莉苹，王珊珊，石艳丽，郭学平，李德杰，于鲁孟，周宁，
申请(专利权)人：华熙生物科技股份有限公司，山东华熙海御生物医药有限公司，
类型：发明
国别省市：山东;37