敲除猪异种抗原的基因的gRNA及其应用制造技术

本申请涉及一种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，使用所述gRNA构建的动物模型，以及他们在生物医药领域中的应用。

【技术实现步骤摘要】
敲除猪异种抗原的基因的gRNA及其应用
本申请涉及生物医药领域，具体的涉及特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA及其应用。
技术介绍
目前，细胞、组织和/或器官移植是许多疾病(包括肾、心、肺、肝和其他器官疾病或皮肤损伤)的常规治疗选择。为了克服缺乏足够的移植物、无法满足临床需求的问题，出现了将来源于一种物种(例如，猪)的移植物移植到另一物种(例如，人类)的异种移植。但是，使用标准的未修饰的异种动物的移植物可能伴随严重的免疫排斥反应。为了解决现有的异种移植治疗中出现的免疫排斥反应，可以通过基因编辑敲除编码某些引起免疫系统反应的蛋白的基因。
技术实现思路
本申请提供了一种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，所述gRNA包含SEQIDNO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。本申请所述的gRNA显著提高了基因的敲除效率。使用本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，可以使β4GalNT2基因的敲除效率达到至少20％以上(例如至少21％以上、22％以上、23％以上、24％以上、25％以上、26％以上、27％以上、28％以上、29％以上或更高)，与使用一种gRNA敲除相比，使用两种所述sgRNA时的敲除效率可以提高至少5％以上(例如，至少10％以上、15％以上、20％以上、25％以上、30％以上、35％以上40％以上、45％以上、50％以上或更高)。本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA还可以和特异性靶向GGTA1和/或CMAH基因的gRNA共同用于基因敲除，可以使三个基因同时敲除的敲除效率达到至少10％以上(例如，至少11％以上、12％以上、13％以上、14％以上、15％以上、16％以上、17％以上、18％以上、19％以上、20％以上、25％以上或更高)。本申请还提供了编码所述gRNA的核酸分子、包括所述核酸分子或sgRNA的细胞、载体、载体转录物、试剂盒和/或系统，和根据所述gRNA制备的动物模型、细胞、组织和/或器官，以及他们的应用。一方面，本申请提供了一种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合SEQIDNO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述gRNA包含SEQIDNO.16所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述gRNA包含SEQIDNO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述sgRNA包含5’-(X)n-SEQIDNO.16所示的核苷酸序列-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。在某些实施方式中，所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。另一方面，本申请提供了一种gRNA组合，其包括本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，特异性靶向GGTA1基因的gRNA和特异性靶向CMAH基因的gRNA。在某些实施方式中，所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA包含SEQIDNO.9所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述特异性靶向CMAH基因的gRNA包含SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。另一方面，本申请提供了一种或多种分离的核酸分子，其编码本申请所述的特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA。另一方面，本申请提供了一种载体，其包含本申请所述的核酸分子。在某些实施方式中，本申请的编码所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA的一种和/或两种核酸分子，编码所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA的核酸分子，以及编码所述特异性靶向CMAH基因的gRNA的核酸分子位于同一载体中。另一方面，本申请提供了细胞，其包含所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，所述的核酸分子，所述的载体，和/或所述的载体的体外转录产物。另一方面，本申请提供了所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，所述的核酸分子，所述的载体，所述的载体的体外转录产物和/或所述的细胞在敲除β4GalNT2基因中的用途，或者在构建动物模型中的用途。另一方面，本申请提供了一种β4GalNT2基因缺失细胞株，其是使用所述特异性靶向β4GalNT2基因的sgRNA，所述的核酸分子，所述的载体，所述的载体的体外转录产物和/或所述的细胞制备获得的。另一方面，本申请提供了一种构建动物模型的方法，所述方法包括向动物的细胞施用至少两种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，从而敲除β4GalNT2基因的全部或部分，其中所述gRNA特异性结合SEQIDNO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA包含SEQIDNO.16所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA包含SEQIDNO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA包含5’-(X)n-SEQIDNO.16所示的核苷酸序列-骨架序列-3’，其中X为选自A、U、C和G中任一个的碱基，且n为0-15中的任一整数。在某些实施方式中，所述gRNA为单链向导RNA(sgRNA)。在某些实施方式中，所述方法包括以下步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述β4GalNT2基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述β4GalNT2基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。在某些实施方式中，所述方法还包括向动物的细胞施用特异性靶向GGTA1基因的gRNA，从而敲除GGTA1基因的全部或部分。在某些实施方式中，所述特异性靶向GGTA1基因的gRNA包含SEQIDNO.9所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述方法还包括向动物的细胞施用特异性靶向CMAH基因的gRNA，从而敲除CMAH基因的全部或部分。在某些实施方式中，所述特异性靶向CMAH基因的gRNA包含SEQIDNO.10所示的核苷酸序列。在某些实施方式中，所述方法包括以下步骤：使用一种或多种脱氧核糖核酸(DNA)核酸内切酶以在所述GGTA1基因和/或所述CMAH基因内或其附近产生一个或更多个单链断裂(SSB)或双链断裂(DSB)，从而使得所述GGTA1基因和/或所述CMAH基因的一个或更多个外显子全部或部分缺失。在某些实施方式中，所述DNA核酸内切酶包括Cas核酸酶。在某些实施方式中，所述Cas核酸酶包括Cas9核酸酶、其同源物、其天然存在分子的重组体、其密码子优化版本，和/或其经修饰版本。在某些实施方式中，所述方法包括：a)提供一种细胞，所述细胞包含一种或多种包含本申请所述的载体或所述gRNA载体的体外转录产物；b)将所述细胞在培养液中进行培养；c)将培养后的细胞移植至受体雌性非人哺乳动物的输卵管内，允许所述细胞在所述雌性非人哺乳动物的子宫中发育；和d)鉴定步骤c)的怀孕雌性的后代基因改造的非人哺乳动物中的种系本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合SEQ ID NO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。/n

【技术特征摘要】
1.一种特异性靶向β4GalNT2基因的gRNA，其中所述gRNA特异性结合SEQIDNO.1-2中任一项所示的核苷酸序列。


2.根据权利要求1所述的gRNA，其中所述gRNA包含SEQIDNO.16所示的核苷酸序列。


3.根据权利要求1-2中任一项所述gRNA，其中所述gRNA包含SEQIDNO.6-7中任一项所示的核苷酸序列。


4.一种或多种分离的核酸分子，其编码权利要求1-3中任一项所述gRNA。


5.载体，其包含权利要求4所述的核酸分子。


6.细胞，其包含权利要求1-3中任一项所述gRNA，权利要求4所述的核酸分子，和/或权利要求5所述的载体。


7.权利要求1-3中任一项所述gRNA，权...

【专利技术属性】
技术研发人员：戴一凡，杨海元，
申请(专利权)人：金佩奇生物科技南京有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏;32