一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系技术

本发明专利技术属于生物技术领域，尤其涉及一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系，其特征在于：所述的试剂体系包括体积份的裂解液480‑520份、蛋白酶K 0.008‑0.012份、除脂液0.4‑0.6份、去蛋白液0.4‑0.6份、磁珠缓冲液0.4‑0.6份、硅羟基磁珠0.02‑0.04份、洗涤缓冲液A 0.8‑1.2份，洗涤缓冲液B 0.8‑1.2份和洗脱缓冲液0.08‑0.12份组成的试剂体系；所述的提取方法包括样品前处理、裂解、去蛋白、去脂、核酸富集、洗脱等步骤。有效去除样品中脂类、盐类等杂质，大大提高了产物纯度和得量，具有安全、快捷、高效、所得产物符合下游试验要求的特点。

【技术实现步骤摘要】
一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系
本专利技术属于生物
，尤其涉及一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系。
技术介绍
核酸是由许多核苷酸聚合成的生物大分子化合物，为生命的最基本物质之一。核酸广泛存在于所有动植物细胞、微生物体内，生物体内的核酸常与蛋白质结合形成核蛋白。不同的核酸，其化学组成、核苷酸排列顺序等不同。根据化学组成不同，核酸可分为核糖核酸(简称RNA)和脱氧核糖核酸(简称DNA)。核酸提取为大量广泛研究和应用提供了信息与材料，比如克隆、Qrt-PCR和全基因组、转录组范畴中的二代测序技术，获得的核酸材料可以多种方式进行应用。核酸提取主要为使细胞或组织样品裂解，首先保证核酸一级结构的完整性，其次要排除其它分子的污染，去除非核酸污染物，如蛋白质、脂类、盐类等杂质。提取核酸时要简化步骤，缩短提取时间，减少化学因素对核酸的降解，减少物理因素对核酸的降解，减少机械剪切力和高温的影响，以及生物降解。传统提取方法在提取过程中需要用到氯仿、苯酚等有毒试剂，会对人体健康和环境造成危害。而且提取时间长，提取步骤繁琐，需要进行反复地离心操作，容易造成机械剪切，得率不稳定。目前使用生物磁珠提取核酸，相比于传统的异戊醇抽提法和离心柱试剂盒法，稳定快速，完整性好。磁珠法通用的操作流程：裂解、结合、洗涤、洗脱。随着磁珠法核酸提取技术的日益普及，基于磁珠法核酸提取开发的全自动核酸提取仪，因其高通量、自动化、减少操作者与试剂及样本的接触、减少人工操作引起的误差，结果稳定，重复性好等特点使得全自动核酸提取仪越来越被市场所接受。动物深加工制品在加工过程中会加入大量油脂、调味品、防腐剂、添加剂等，干扰核酸提取中产物的洗涤纯化。而且一般会经过高温、油炸、脱水等处理，使得核酸片段较小，含量较低，不易提取。深加工制品消化较困难，杂质较多，对试剂体系及试剂盒的性能要求较高，大多数操作过程需要高温孵育，造成实验室气溶胶污染严重。同时市场上其他在售生物磁珠类试剂盒提取所得核酸产物浓度和纯度过低，不能很好符合下游试验如qPCR、测序等要求，在实际检测过程中容易出现假阴性。
技术实现思路
为了解决以上技术问题，本专利技术提供一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系，填补了动物深加工制品的高纯核酸提取的空白，通过增加样品前处理，加入除脂液和改良洗涤液的方式，有效去除样品中脂类、盐类等杂质，大大提高了产物纯度和浓度，通过常温裂解和洗脱，有效避免实验室气溶胶交叉污染，具有安全、快捷、所得产物符合下游试验要求的特点。解决以上技术问题的本专利技术中的一种提取动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系，其特征在于：包括体积份的裂解液400-800份、蛋白酶K0.008-0.012份、除脂液0.4-0.6份、去蛋白液0.4-0.6份、磁珠缓冲液0.4-0.6份、硅羟基磁珠0.02-0.04份、洗涤缓冲液A0.8-1.2份，洗涤缓冲液B0.8-1.2份和洗脱缓冲液0.05-0.15份组成的试剂体系。优化方案中，所述试剂体系中裂解液500份、蛋白酶K0.01份、除脂液0.5份、去蛋白液0.5份、磁珠缓冲液0.5份、硅羟基磁珠0.03份、洗涤缓冲液A1份，洗涤缓冲液B1份和洗脱缓冲液0.1份。所述裂解液包括0.1mol/LTris-cl，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)质量分数为5％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)。所述磁珠缓冲液为异丙醇。所述磁珠悬浮液，质量浓度为50mg/mL。所述洗涤缓冲液A包括0.8mol/L氯化锂，1mmol/LEDTA和0.01mol/LTris-cl,使用前加入1.5倍体积的无水乙醇并混匀。洗涤缓冲液A需要使用时现加入无水乙醇，即若洗涤缓冲液A有100mL，则氯化锂、EDTA和Tris-Cl的混合溶液仅有40mL，使用时需现场加入60mL无水乙醇。所述洗涤缓冲液B为体积浓度为80％的乙醇。所述洗脱缓冲液为TE溶液。(10mmol/LTris·Cl(pH＝8.0),1mmol/LEDTA(pH＝8.0))所述除脂液为正己烷。非极性溶剂，与水相互不相溶，溶解脂类能力强，低毒，廉价易得，常用溶剂。蛋白酶K是一种从白色念珠菌分离出来的强力蛋白溶解酶，具有很高的比活性，是DNA提取的关键试剂。主要作用为酶解与核酸结合的组蛋白，使DNA游离在溶液中。蛋白酶K(20mg/mL)。所述去蛋白液包括盐酸胍5mol/L，Tris-cl0.1mol/L，EDTA20mmol/L，NaCl1.0mol/L和1％的TritonX-100。去蛋白液为可溶解蛋白质，导致细胞结构破坏，核蛋白二级结构破坏，从核酸上解离下来。本专利技术中每种试剂的浓度、用量、体系不同，整体效果都会发生较大变化。去蛋白液中还包括有1％TritonX-100，TritonX-100是一种非离子表面活性剂，与CTAB这种离子表面活性剂作用类似，可以裂解细胞，而且不会中和离子表面活性剂，影响其效果，没有加在裂解液里面是因为会导致溶液过于粘稠，影响裂解液与样品的结合。本专利技术中一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系，进行裂解和吸附核酸包括以下步骤：(1)对样品进行清洗、去杂、浓缩等前处理。充分洗清深加工动物制品中的非目标物以及通过物理方式破坏胶体稳定性，并分离、浓缩。取适量样品加入50mL离心管，加入约2倍体积的75％无水乙醇，上下颠倒或置于摇床上充分混匀，弃去液体，再重复1-2次。然后加入约2倍体积的无菌双蒸水，上下颠倒或置于摇床上充分混匀，弃去液体，再重复1-2次。悬乳浊或浊状的液体动物制品，如酱肉、牛板筋等，可通过物理方式破坏胶体稳定性并分离、浓缩。取适量样品加入2mL离心管，8000g离心5min并弃去上清液，再次加入适量样品，8000g离心5min并弃去上清液。采用均质器、搅拌机、研钵等实验器具对样品进行均质处理。(2)加入样品至装有裂解液离心管中，再加入蛋白酶K，室温孵育消化25-35min，期间颠倒混匀3次；常温裂解，不造成气溶胶扩散而导致实验室污染；(3)加入除脂液，混匀、离心，吸取上层液体；加入正己烷除去脂类，通过离心分离。(4)加入去蛋白液，70-80℃温浴12-18min，期间混匀1-3次，室温静置8-12min；(5)加入磁珠缓冲液和磁珠悬浮液，混匀后静置，静置1-3min；(6)将离心管放置于磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去液体。(7)加入洗涤液A混匀后磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去液体。(8)加入洗涤液B混匀，磁力架上静置，磁珠完全吸附后，除去液体，重复1次，共2次。(9)将离心管开盖放置于磁力架上，室温晾干10-15min。(10)加入洗脱液，混匀，室温放置8-12min；(11)将离心管置于磁力架上静置1-3min，磁珠完全吸附后，将DNA溶液转移至新的离心管中，低温保存。所述低温为-20本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动物深加工制品的高纯核酸提取试剂体系，特征在于：包括体积份的裂解液400-800份、蛋白酶K 0.008-0.012份、除脂液0.4-0.6份、去蛋白液0.4-0.6份、磁珠缓冲液0.4-0.6份、硅羟基磁珠0.02-0.04份、洗涤缓冲液A 0.8-1.2份，洗涤缓冲液B 0.8-1.2份和洗脱缓冲液0.08-0.12份组成的试剂体系。/n

【技术特征摘要】
1.一种动物深加工制品的高纯核酸提取试剂体系，特征在于：包括体积份的裂解液400-800份、蛋白酶K0.008-0.012份、除脂液0.4-0.6份、去蛋白液0.4-0.6份、磁珠缓冲液0.4-0.6份、硅羟基磁珠0.02-0.04份、洗涤缓冲液A0.8-1.2份，洗涤缓冲液B0.8-1.2份和洗脱缓冲液0.08-0.12份组成的试剂体系。


2.根据权利要求1所述的一种动物源性深加工制品的高纯核酸提取试剂体系，其特征在于：所述试剂体系中裂解液500份、蛋白酶K0.01份、除脂液0.5份、去蛋白液0.5份、磁珠缓冲液0.5份、硅羟基磁珠0.03份、洗涤缓冲液A1份，洗涤缓冲液B1份和洗脱缓冲液0.1份。


3.根据权利要求1所述的一种动物源性深加工制品的高纯核酸提取试剂体系，其特征在于：所述裂解液包括0.1mol/LTris-cl，1.4mol/LNaCl，20mmol/LEDTA(乙二胺四乙酸)和质量分数为5％的CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)。


4.根据权利要求1所述的一种动物深加工制品的高纯核酸提取方法及试剂体系，其特征在于：所述磁珠缓冲液为异丙醇。


5.根据权利要求1所述的一种动物深加工制品的高纯核酸提取试剂体系，其特征在于：所述洗涤缓冲液A包括0.8mol/L氯化锂，1mmol/LEDTA和0.01mol/LTris-Cl,使用前加入1.5倍体积的无水乙醇；所述洗涤缓冲液B为体积浓度为80％的乙醇；所述洗脱缓冲液为TE溶液；所述除脂液为正己烷。


6.根据权利要求1所述的一种动物深加工制品的高纯核酸提取试剂体系，其特征在于：所述去蛋白液包括盐酸胍5mol/L，Tris-cl0.1mol/L，EDTA20mmol/L，NaCl1.0mol/...

【专利技术属性】
技术研发人员：周李华，杨杰斌，马丽侠，李怀平，叶德萍，蒋子敬，姜展樾，乔倩，
申请(专利权)人：中国测试技术研究院，
类型：发明
国别省市：四川;51