一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌及其筛选方法技术

本发明专利技术公开了一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌（

【技术实现步骤摘要】
一种对柑橘砂皮病有抑制作用的枯草芽孢杆菌及其筛选方法
本专利技术涉及一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的新菌株及其筛选方法、和最适发酵条件优化。
技术介绍
柑橘砂皮病的病原有性态为柑橘间座壳(Diaporthcitri)，经Wolf等人分离发现，病原无性态为柑橘拟茎点霉(Phomopsiscitri),由Fawsett等人分离发现，病原菌分生孢子器在表皮下形成，球形、椭圆形或不规则形，具有瘤状孔口，分生孢子无色透明，有两种形态：α型，孢子呈椭圆形或纺锤形，单孢，内一般含2个油球，有时含多个油球，易萌发；β型，正直细长或弯曲呈钩状，无油球，该类型孢子不易萌发。一般以α型孢子居多，β型孢子较少见。病原菌最适生长温度为25℃左右，高于35℃或低于20℃会导致菌丝生长缓慢，分生孢子在5℃～35℃均可萌发；在PDA培养基上培养，菌丝白色密集，呈放射状向四周生长，培养14d左右产生子实体，培养基表面出现单独或成堆的黑色分生孢子座，上着生分生孢子器，分生孢子器上产生白色或淡黄色滴状物即为分生孢子。该病为真菌寄生性病害，由于绝大部分柑橘果树枝叶带刺，在雨季刮大风时，树枝被风刮动，互相之间摩擦会造成伤口，加上大量降雨也易导致孢子大量繁殖，孢子萌发后在空气中四处飞散会导致病害的大范围传播。病原菌为弱寄生菌，通常在树势衰弱时或有伤口时侵染柑橘，以菌丝体或分生孢子器在病叶、病枝上越冬，病株上的分生孢子器在环境适宜的情况下可以产生大量分生孢子，来年条件合适时进行新一轮的侵染。有人指出，这些黑点的出现，是柑橘作为寄主本身做出防卫反应的产物。也有研究指出，柑橘砂皮的发病条件也与柑橘的种类有一定关系。目前来看，化学药剂是防治柑橘砂皮病的主要方法。但是长期单一使用某一种化学药剂，容易产生抗药性，影响防治效果。由于柑橘砂皮病的特性，需要在一年内多次施药进行防治，化学药剂大量使用对环境造成污染以及对人体健康的潜在危害。因此，筛选出对柑橘砂皮病菌有抑制作用的微生物是防治柑橘砂皮病的最佳途径。
技术实现思路
针对上述问题，本专利技术人从湖南省怀化市麻阳县柑橘砂皮病发生的不同橘园采集健康柑橘叶片，分离柑橘叶内生菌，通过稀释平板法获得细菌的单菌落，再采用平板对峙法筛选得到一株对柑橘砂皮病有较好抑制作用的细菌，将该菌命名为M-23，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)。本专利技术人经过研究发现该菌对人畜无致病性，能安全地用于柑橘砂皮病的生物防治。同时，M-23菌株对水稻纹枯病菌、花生冠腐病菌、花生白绢病菌、草莓灰霉病菌也有一定的抑制作用。本专利技术提供的技术方案是：一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌，其是保藏号为CGMCCNo.17205的枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。本专利技术所述的细菌M-23(枯草芽孢杆菌，拉丁名：Bacillussubtilis)已于2019年1月16日为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心CGMCC所保藏(保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，其保藏号为CGMCCNo.17205，经检测存活。同时，本专利技术还提供所述对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌的筛选方法，其步骤如下：(1)从叶片中分离细菌样品，将采集的柑橘叶片用流水冲洗，剪成1cm2的小块，用75％的酒精浸泡30s，然后1％的次氯酸钙溶液浸泡4min，无菌水冲洗5次，备用；(2)利用稀释法进行分离，将消毒后的叶片小块放在无菌研钵中研磨成浆液，用无菌水稀释，制备10-2、10-3、10-4稀释液，吸取稀释液滴加到NA培养基平板上，涂布均匀，将培养皿放在恒温培养箱中28℃倒置培养；(3)筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌采用平板对峙法筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌：将纯化的细菌菌株，用NA培养基培养，柑橘砂皮病菌在PDA培养基上培养7天后，用7mm打孔器打菌饼，将其接入含PDA培养基的培养皿中央，四周均匀对称接入细菌，培养7-14d后观察测量抑菌圈直径，选择拮抗作用明显的细菌，保存。同时，本专利技术还提供所述的细菌在防治柑橘砂皮病中的应用。本专利技术所述的细菌对水稻纹枯病菌、花生冠腐病菌、花生白绢病菌、草莓灰霉病菌也有一定的抑制作用。所述的应用，其利用所述细菌的发酵液、或发酵液提取物进行应用。本专利技术还提供一种农用杀菌剂，其包含所述的细菌，优选的是其包含所述菌株的发酵液。同时，本专利技术还通过单因素控制法和多因素正交分析确定了最佳发酵液成分为：葡萄糖15g/L，玉米粉15g/L，NaCl3.5g/L，K2HPO41.5g/L；最佳发酵条件：以28℃、180r/min、pH＝7.5、发酵时间为72h。本专利技术具有以下有益效果：本专利技术细菌M-23是专利技术人从湖南省怀化市麻阳县有柑橘砂皮病发生的柑橘园采集的健康叶片样品中分离而得，经鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，经过田间试验该菌的发酵液稀释30倍的发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为79.09％，稀释50倍发酵液对柑橘砂皮病的防治效果为68.97％。同时该菌具有广谱抑菌性，对花生白绢病菌、花生冠腐病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌也有一定的抑制作用。该菌对人畜无致病性，能安全地用于柑橘砂皮病的生物防治，能够减少化学农药的使用量，降低环境的污染，促进绿色农业的发展。目前国内还没有将枯草芽孢杆菌用柑橘砂皮病防治的报道。因此，该拮抗菌株具有很好的应用前景。附图说明图1为本专利技术细菌M-23发酵液不同浓度对柑橘砂皮病菌的抑制效果。图2为本专利技术细菌M-23对花生白绢病菌、花生冠腐病菌、水稻纹枯病菌、草莓灰霉病菌的抑制效果，其中，(a).花生白绢病菌(b).花生冠腐病菌(c).水稻纹枯病菌(d).草莓灰霉病菌。图3为本专利技术细菌M-23的培养性状、革兰氏染色和芽孢染色图片，其中，(a).菌落形态(b).革兰氏染色(c).芽孢染色。图4为本专利技术细菌M-23DNA的PCR扩增凝胶电泳。图5为本专利技术细菌M-23的16SrDNA的序列图。图6为本专利技术细菌M-23序列基于16srDNA序列构建的系统发育进化树。具体实施方式实施例1：菌株的筛选和鉴定本专利技术对柑橘砂皮病有抑制作用的细菌的筛选方法如下：1、柑橘叶片的采集从湖南省怀化市麻阳县柑橘砂皮病发生的不同橘园采集健康柑橘叶片带回实验室。2、细菌的分离利用稀释法进行分离。将叶片用流水冲洗后，在75％的酒精中浸30s，在1％次氯酸钠溶液中浸泡4min，无菌水冲洗5次后，剪碎成大小约为1cm2的小块置于灭菌后的研钵中进行研磨，用无菌水稀释，制备10-2、10-3、10-4稀释液，分别吸取稀释液100μL滴加到NA培养基(牛肉膏3g、琼脂20g、氯化钠5g、蛋白胨10g、ddH2O1000mL，调pH至7.2)平板上，涂布均匀，将培养皿放在28℃恒温培养箱中倒置培养。3、拮抗细菌的筛选采用本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌，其是保藏号为CGMCC No.17205的枯草芽孢杆菌（

【技术特征摘要】
1.一种对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌，其是保藏号为CGMCCNo.17205的枯草芽孢杆菌（Bacillussubtilis），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。


2.一种权利要求1所述的对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌的筛选方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将采集的柑橘叶片用流水冲洗，剪成小块，用75%的酒精浸泡30s，然后1%的次氯酸钙溶液浸泡2～6min，无菌水冲洗4～7次，备用；
（2）利用稀释法进行分离，将消毒后的叶片小块放在无菌研钵中研磨成浆液，用无菌水稀释，制备10-2、10-3、10-4稀释液，吸取稀释液滴加到NA培养基平板上，涂布均匀，将培养皿放在恒温培养箱中28℃倒置培养；
（3）筛选对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌。


3.一种权利要求1所述的对柑橘砂皮病菌有抑制作用的细菌在...

【专利技术属性】
技术研发人员：易图永，李审微，洪艳云，何可佳，戴良英，李新文，谭小平，
申请(专利权)人：湖南农业大学，
类型：发明
国别省市：湖南;43