一种黑果枸杞多糖LRP3-S1、其制备方法及其用途技术

本发明专利技术提供了从黑果枸杞果实当中获得一种黑果枸杞多糖LRP3‑S1的制备方法和该多糖抑制胰腺癌细胞增殖和侵袭的用途、在制备预防和/或治疗胰腺癌的药物或保健品中的用途。采用水提醇沉的方法及层析柱分离纯化得到均一多糖，通过化学和物理方法鉴定了该多糖的RG‑I结构。经体外实验证明，该多糖能抑制胰腺癌细胞的增殖并减弱其侵袭能力。因此，所述多糖具有潜在的治疗胰腺癌的作用，可能成为一种抗胰腺癌的糖类药物。

【技术实现步骤摘要】
一种黑果枸杞多糖LRP3-S1、其制备方法及其用途
本专利技术涉及了一种多糖的用途，确切的说涉及了一种从黑果枸杞(LyciumruthenicumMurr)当中提取得到的RG-I型果胶，还提供了其制备方法，以及其在治疗胰腺癌过程中的用途、在制备预防和/或治疗胰腺癌的药物或保健品中的用途。
技术介绍
胰腺癌(Pancreaticcancer)是恶性程度最高，预后最差，五年存活率最低的实体性肿瘤之一。同时胰腺癌具有较高的侵略性，通常在癌症的早期进行转移，侵袭到基质和血管及其外周组织，使死亡率大大提高。因此，成为目前人们备受关注的重大疾病之一。黑果枸杞是中国西北地区一种特有的药食两用植物，具有补肾益精，养肝明目，补血安神清热除蒸等功效，民间具有“软黄金”之称，主要分布于宁夏、甘肃、青海和新疆等省。黑果枸杞主要用于治疗心脏病、高血压、月经不调、更年期紊乱、尿道结石、牙龈出血等。多糖作为黑果枸杞当中的主要成分，已被报道具有抗疲劳、免疫调节、消炎、降血糖、抗氧化的功效，而对抗肿瘤方面的报道较少。
技术实现思路
本专利技术用一种简单有效的提取和纯化植物多糖的工艺和方法，以青海产地的黑果枸杞为原料获得了一种果胶多糖，通过体外实验证明，该多糖能剂量依赖性地抑制体外胰腺癌细胞的生长，减弱了胰腺癌细胞的侵袭能力。该多糖通过阻断FAK/AKT/GSK-3β和p38信号通路来干预胰腺癌细胞的增殖和侵袭，从而达到抗胰腺癌的作用。因此该多糖具有潜在的治疗胰腺癌的效果，有望开发成为一种治疗胰腺癌疾病的糖类药物。为解决上述专利技术目的，本专利技术提供了一种黑果枸杞多糖LRP3-S1，其单糖组成的摩尔百分比为：鼠李糖14.4％，半乳糖醛酸17.7％，半乳糖26.6％，木糖16.4％和阿拉伯糖24.9％。优选地，所述黑果枸杞多糖LRP3-S1具有如下结构：其中，所述黑果枸杞多糖LRP3-S1的分子量在100–120kDa，优选为114.8kDa；其中a,b,c三部分的比例固定不变。本专利技术还提供了所述黑果枸杞多糖LRP3-S1的制备方法，其包括如下步骤：(1)多糖的提取：黑果枸杞沸水提取，得到提取液，对提取液进行浓缩，向浓缩液中加入乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，得粗多糖；(2)多糖的纯化：粗多糖经DEAESepharoseTMFastFlow阴离子交换柱分离，收集0.2MNaCl洗脱液的洗脱组份；该洗脱组份再经过SephacrylS-300HR凝胶柱进一步纯化，得到所述黑果枸杞多糖LRP3-S1。优选地，步骤(1)中，在进行沸水提取前，先用乙醇对黑果枸杞浸泡3～10天(比如7天)，然后风干；优选地，步骤(1)中，沉淀所用乙醇为体积分数95％的乙醇；沉淀所用的乙醇体积为浓缩液的3～6倍(比如5倍)；优选地，步骤(1)中，在进行乙醇沉淀前，先对浓缩液进行离心，然后对离心上清液进行透析，透析时间优选为24～48h；优选地，步骤(1)得到的粗多糖在进行步骤(2)的多糖纯化前进行洗涤，采用乙醇和丙酮交替洗，各洗涤2-4次；优选地，步骤(2)所述阴离子交换柱分离时依次使用0.05M、0.1M、0.2M的NaCl溶液进行梯度洗脱，收集0.2MNaCl洗脱液的洗脱组份；优选地，步骤(2)所述SephacrylS-300HR凝胶柱进一步纯化时，使用0.2MNaCl洗脱液进行洗脱，收集得到的洗脱组分为黑果枸杞多糖LRP3-S1。本专利技术对所得到的黑果枸杞多糖LRP3-S1的鉴定，包括进行纯度及分子量的测定，然后采用部分酸水解，糖组成的测定，甲基化，红外及核磁共振等方法对其结构进行解析。本专利技术还提供了一种药物组合物，其包含所述黑果枸杞多糖LRP3-S1，以及药学上可接受的辅料。本专利技术还提供了所述黑果枸杞多糖LRP3-S1或所述药物组合物在制备预防和/或治疗胰腺癌的药物或保健品中的用途。附图说明图1为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1高效液相色谱的纯度图。图2为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1的红外谱图。图3为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1的1HNMR和13CNMR图谱。图4为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1对胰腺癌细胞和正常细胞存活率情况的影响柱状图。图5为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1影响BxPC-3胰腺癌细胞侵袭的小室穿膜实验图。图6为制备实施例1中制得的黑果枸杞多糖LRP3-S1对BxPC-3细胞当中蛋白水平表达的免疫印迹图。具体实施方式制备实施例1黑果枸杞多糖LRP3-S1的提取分离纯化和结构表征(1)多糖的提取分离将黑果枸杞果实用工业乙醇浸泡一周，浸泡之后的黑果枸杞进行风干，然后用沸水提取法提取，硫酸-苯酚法检测提取液的糖含量，直至糖反应不明显。合并提取液，浓缩至小体积后，离心去沉淀。将上清液用对流水透析两天。透析内液用体积分数95％的乙醇以提取液与乙醇的体积比为1：5(v/v)进行醇沉，静置过夜。弃掉上层多余乙醇，沉淀离心后将沉淀用乙醇和丙酮交替洗三次，干燥后得水提粗多糖(93.3g)。(2)多糖的纯化每次取6g粗多糖溶解于80mL去离子水中，搅拌过夜，离心取上清上样于DEAESepharoseTMFastFlow阴离子交换柱，用去离子水和不同浓度的NaCl溶液(0.05M、0.1M、0.2M)进行梯度洗脱，流速控制在13mL/15min，用自动收集仪收集。每管取100μL用硫酸-苯酚法显色并用酶标仪在490nm下检测其吸光度，用吸光度和洗脱体积绘制洗脱曲线。根据洗脱曲线收集分离的多糖进行减压浓缩、透析、冷冻干燥，最后得到0.2MNaCl洗脱液的洗脱组分(次级粗多糖LRP3)。每次将200mg的次级粗多糖LRP3溶于3mL去离子水中，离心(4,000r/min)取上清上样于SephacrylS-300HR凝胶柱，经0.2MNaCl洗脱液洗脱，流速控制在5mL/15min，自动收集仪收集。经过硫酸苯酚法显色、酶标仪检测吸光度并绘制洗脱曲线，收集所需的分离组分进行浓缩透析，最后冷冻干燥得到该均一的黑果枸杞多糖LRP3-S1(0.5g)。(3)多糖的结构鉴定多糖LRP3-S1在串连UltrahydrogelTM802和UltrahydrogelTM804分析凝胶柱上的特征图谱如图1所示，其色谱条件为：流动相：0.1MNaNO3；流速：0.6mL/min；柱温：40℃；Agilent1260液相色谱仪；检测器：示差检测器和紫外检测器。取黑果枸杞多糖LRP3-S1样品约2mg，采用溴化钾压片法测定多糖的红外光谱，结果如图2，3429.52cm-1为O-H的伸缩振动吸收峰。2931.54cm-1为C-H的伸缩振动吸收峰。1420.32cm-1和1050.29cm-1分别为环外和环内的C-O伸缩振动。1735.01cm-1来自于羧基的C＝O的伸缩振动，说明该本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种黑果枸杞多糖LRP3-S1，其特征在于，其单糖组成的摩尔百分比为：鼠李糖14.4％，半乳糖醛酸17.7％，半乳糖26.6％，木糖16.4％和阿拉伯糖24.9％。/n

【技术特征摘要】
1.一种黑果枸杞多糖LRP3-S1，其特征在于，其单糖组成的摩尔百分比为：鼠李糖14.4％，半乳糖醛酸17.7％，半乳糖26.6％，木糖16.4％和阿拉伯糖24.9％。


2.如权利要求1所述的黑果枸杞多糖LRP3-S1，其特征在于，具有如下结构：

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3.如权利要求1或2所述的黑果枸杞多糖LRP3-S1，其特征在于：分子量为100～120kDa，优选为114.8kDa。


4.权利要求1～3中任一项所述黑果枸杞多糖LRP3-S1的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)多糖的提取：黑果枸杞沸水提取，得到提取液，对提取液进行浓缩，向浓缩液中加入乙醇进行沉淀，离心收集沉淀，得粗多糖；
(2)多糖的纯化：粗多糖经DEAESepharoseTMFastFlow阴离子交换柱分离，收集0.2MNaCl洗脱液的洗脱组份；该洗脱组份再经过SephacrylS-30...

【专利技术属性】
技术研发人员：丁侃，陈霞，张世海，何菲，
申请(专利权)人：中国科学院上海药物研究所，
类型：发明
国别省市：上海;31